多發(fā)性骨髓瘤側(cè)群細(xì)胞的研究.pdf

1、第一部分，多發(fā)性骨髓瘤側(cè)群細(xì)胞分選及生物學(xué)特性的體外鑒定
　　 [目的]：鑒定多發(fā)性骨髓瘤側(cè)群細(xì)胞的存在及生物學(xué)特性
　　 [方法]：應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選七例多發(fā)性骨髓瘤患者原代標(biāo)本及五個(gè)MM細(xì)胞株的SP細(xì)胞。通過細(xì)胞周期、免疫表型、集落形成實(shí)驗(yàn)、ABCG2mRNA表達(dá)量等對SP進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定。并在不同MM治療藥物(A、硼替佐米、As203)作用下，分別使用MTT和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測對骨髓瘤SP增殖、活力和集落形成能力

2、的影響。
　　 [結(jié)果]：本研究檢測了5種MM細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞含量波動(dòng)于0.8256-1.762％，并在7例MM患者骨髓標(biāo)本中檢測到SP細(xì)胞占0.04-2.0％。與MP相比，SP細(xì)胞多處于G0/G1期(95.47％VS49.36％，P<0.05)，較少的細(xì)胞處于S期(3.27％VS40.84％，P<0.05)。在免疫表型研究中，觀察到SP和MP的CD138、CD38表達(dá)并無顯著差異，分別為(78.5±8.5)％VS(82.0

3、±4.0)％和(72.3±15.7)％VS(84.3±11.9)％，P>0.05。MM細(xì)胞株NCI-H929的SP細(xì)胞的集落形成數(shù)明顯高于MP細(xì)胞(1392±257VS550±15，P=0.08)。Realtime-PCR顯示SP細(xì)胞ABCG2的表達(dá)明顯高于MP細(xì)胞(P<0.05)。MTT顯示在藥物相同的作用濃度下，NCI-H929、RPMI8226的細(xì)胞生長抑制率隨時(shí)間的延長逐漸增加?；衔顰(4μM、8μM)、硼替佐米(10nM、2

4、5nM)及三氧化二砷(1.25μM、2.5μM)分別對NCI-H929及RPMI8226作用24H后，流式細(xì)胞儀檢測SP細(xì)胞的比例變化，發(fā)現(xiàn)藥物A能夠特異性的殺傷SP細(xì)胞，而對其他細(xì)胞作用不明顯，硼替佐米及三氧化二砷非特異性殺傷整體細(xì)胞，對SP細(xì)胞沒有特異性的殺傷作用；而來那度胺(200μM、400μM)作用MM細(xì)胞株NCI-H929及RPMI822624H后，能特異性的減少SP細(xì)胞比例。分別用化合物A(8μM)和硼替佐米(10nM)作

5、用MM細(xì)胞株NCH-H929的SP、MP細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)均能降低SP、MP的集落形成，化合物A分別作用于SP、MP，集落形成數(shù)目分別為354±9、287±84，硼替佐米分別作用于SP、MP，集落形成數(shù)目分別為80±23、36±41。
　　 [結(jié)論]：MM細(xì)胞株及原代患者均存在SP細(xì)胞，MM細(xì)胞株的SP細(xì)胞在細(xì)胞周期、集落形成能力及ABCG2表達(dá)量上與MP均存在顯著性差異，而SP和MP在CD38和CD138的表達(dá)上無顯著性差異。不同濃度

6、的化合物A、硼替佐米、三氧化二砷對MM細(xì)胞株NCI-H929、RPMI8226均有抑制作用，并且在一定濃度范圍內(nèi)呈時(shí)間和劑量依賴性。藥物A能夠特異性的殺傷SP細(xì)胞，而對其他細(xì)胞作用不明顯，硼替佐米及三氧化二砷非特異性殺傷整體細(xì)胞，對SP細(xì)胞沒有特異性的殺傷作用。來那度胺對MM細(xì)胞株NCI-H929及RPMI8226的SP細(xì)胞作用不明顯。化合物A和硼替佐米均能降低MM細(xì)胞株NCI-H929SP、MP的集落形成。
　　 第二部分，多

7、發(fā)性骨髓瘤側(cè)群miRNA表達(dá)譜鑒定及相關(guān)研究
　　 [目的]：篩選骨髓瘤SP細(xì)胞相關(guān)miRNA表達(dá)譜，生物信息學(xué)分析預(yù)測靶基因及信號通路，進(jìn)而證明某些特異性的miRNA表達(dá)變化可能影響靶基因表達(dá)變化的新機(jī)制，從而為改善骨髓瘤治療開拓新的領(lǐng)域。
　　 [方法]：miRNA芯片技術(shù)篩選MMSP細(xì)胞和MP細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜。流式細(xì)胞儀分選MM細(xì)胞株NCI-H929、RPMI8226和LP-1及3例MM患者的SP細(xì)胞及MP細(xì)

8、胞，tealtime-PCR技術(shù)驗(yàn)證芯片結(jié)果。生物信息學(xué)技術(shù)分析MMSP細(xì)胞相關(guān)通路及靶基因，Werternblotting檢測MMSP和MP細(xì)胞在MAPKs信號傳導(dǎo)通路上Erk1/2表達(dá)量的區(qū)別。
　　 [結(jié)果]：分別使用兩種芯片平臺(tái)，檢測了兩對多發(fā)性骨髓瘤原代標(biāo)本及RPMI8226骨髓瘤細(xì)胞的SP和MP細(xì)胞，存在于骨髓瘤SP細(xì)胞相關(guān)特異miRNA表達(dá)譜，包括10個(gè)miRNAs在MM的SP細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，33個(gè)miRNAs

9、在MM的SP細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)；而后采用real-timePCR技術(shù)細(xì)胞驗(yàn)證芯片結(jié)果(miR-144，miR-451，miR-150)，發(fā)現(xiàn)同芯片結(jié)果相同，SP于MP對比，miR-144和miR-451顯著上調(diào)，miR-150顯著下調(diào)。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的有30個(gè)通路(P<0.01)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，其中與腫瘤干細(xì)胞及MM發(fā)病相關(guān)的通路包括：Pathwaysincancer，F(xiàn)ocaladhesion，Endocytosi

10、s，MAPKsignalingpathway，ErbBsignalingpathway，Wntsignalingpathway，mTORsignalingpathway，Ubiquitinmediatedproteolysis，TGF-betasignalingpathway。Westernblotting技術(shù)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)SP的p-Erk1/2、p-S6、p-S6K1、p-Src表達(dá)量明顯下調(diào)，TSC1表達(dá)無明顯變化。免疫熒光技術(shù)證實(shí)了SP