PARP抑制劑在阿霉素誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞自噬發(fā)生中的功能研究.pdf

1、研究背景和目的：自噬（autophagy）是蛋白降解的一種動(dòng)態(tài)過程，在營養(yǎng)匱乏時(shí)可有典型出現(xiàn)。自噬作為一種溶酶體依賴的降解路徑,經(jīng)常在放療或化療的腫瘤細(xì)胞中發(fā)生，但其在腫瘤細(xì)胞中是保護(hù)細(xì)胞還是促進(jìn)細(xì)胞死亡尚存爭議。大量研究表明，藥理或遺傳機(jī)制上抑制自噬，不同類型細(xì)胞可產(chǎn)生不同結(jié)果。多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)的高蛋白合成與分泌活性使其與蛋白降解的主要方式—自噬（autophagy），有著千絲萬縷的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)室研

2、究已證實(shí)阿霉素在骨髓瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的自噬對骨髓瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用。聚（ADP-核糖）聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]是蛋白質(zhì)翻譯后的修飾酶，在DNA損傷斷裂時(shí)，其聚ADP核糖基化作用可催化尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide-adeninedinucleotide,NAD+）裂解為二磷酸腺苷核糖（ADP-ribose）和尼克酰胺，并將二磷酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移至受體蛋白谷氨酸殘基上形成聚二磷酸腺

3、苷核糖聚合物[poly(ADPribose),PAR]。PAR也能通過電荷排斥作用，防止附近的DNA分子與受損的DNA進(jìn)行重組，并能引導(dǎo)DNA修復(fù)酶與缺口接觸，進(jìn)行修復(fù)。每合成1molPAR，需要消耗1molNAD+和4當(dāng)量ATP，因此，當(dāng)PARP的反復(fù)活化過度時(shí)，將會引起細(xì)胞內(nèi)NAD+和ATP的水平下降。PARP被證實(shí)參與不同的細(xì)胞死亡路徑，抑制它可在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生不同效應(yīng)。那么抑制PARP對阿霉素（doxorubicin，DOXO）

4、誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞自噬及其死亡會有什么樣的作用呢?它們之間又有什么具體的聯(lián)系呢?本課題以多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)細(xì)胞系NCI-H929（H929）為實(shí)驗(yàn)對象,探討PARP抑制劑ANI(4-amino-1,8-naphthalimide)對阿霉素誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞自噬的作用及其可能的分子機(jī)制，從而進(jìn)一步為多發(fā)性骨髓瘤的新治療方法提供思路。
　　方法和結(jié)果：1、阿霉素（doxorubicin）引起MM細(xì)胞

5、凋亡：MTT實(shí)驗(yàn)顯示，分別采用0.3125,0.625,1.25,2.5,5umol/l阿霉素處理H929細(xì)胞24h，各處理組活細(xì)胞百分比下降且呈濃度依賴性，提示阿霉素（doxorubicin）能夠有效誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤MM細(xì)胞死亡。臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)顯示，以此H929細(xì)胞IC50值（2.2umol/l）處理細(xì)胞24h，相對未處理組活細(xì)胞百分比為85.5％。Caspase抑制劑zVAD.fmk（10umol/l預(yù)孵育2h，MM細(xì)胞非抑制濃度）

6、可顯著抑制阿霉素誘導(dǎo)的H929細(xì)胞死亡(P<0.05)；2、聚ADP核糖基化作用被激活:①DOXO2.2umol/l分別孵育H929細(xì)胞0,0.5,1,2,5h,westernblot顯示：細(xì)胞內(nèi)PAR呈時(shí)間依賴性上升，2h達(dá)到高峰，5h顯示為下降；②2.2umol/l阿霉素處理H929細(xì)胞不同時(shí)間（0,15,30,45,60min），細(xì)胞內(nèi)ATP相對未處理組分別百分比為95±0.35％,57±0.56％,56±0.16％,51±1.2

7、％，均顯著低未處理組（P＜0.05）；3、阿霉素作用骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)自噬，ATP上升保護(hù)細(xì)胞:①DOXO2.2umol/l處理H929細(xì)胞0,1,6,12,24h,westernblot檢測靶細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)呈時(shí)間依賴性顯著增加；②2.2umol/l阿霉素處理H929細(xì)胞24h，檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平，相對未處理組百分比為233％；3MA10mM抑制自噬，ATP水平下降，細(xì)胞死亡率增加；4、ANI,寡霉素（Oligomy

8、cin）,丙酮酸甲酯(methylpyruvate，MP)分別與阿霉素聯(lián)用，對骨髓瘤細(xì)胞自噬、ATP及存活率的影響：ANI（10umol/l預(yù)孵育1h）聯(lián)合DOXO，Oligomycin1umol/l預(yù)孵育1h聯(lián)合用藥，MP1mmol/l預(yù)孵育8h聯(lián)合DOXO處理H929。①M(fèi)TT顯示:ANI聯(lián)合DOXO對H929細(xì)胞可產(chǎn)生增敏作用，與DOXO單藥作用相比差異顯著（P<0.05)；Oligomycin1umol/l預(yù)孵育1h聯(lián)合用藥，促

9、進(jìn)細(xì)胞對阿霉素的敏感性（P<0.05）。臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)：MP聯(lián)合用藥較DOXO單處理組，活細(xì)胞百分比上升，差異顯著(P<0.05)；②ATP生物發(fā)光檢測證實(shí)：PARP抑制劑ANI、能量抑制劑Oligomycin、自噬抑制劑3MA、caspase抑制劑zVAD.fmk可顯著降低阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ATP水平（P<0.05）；MP聯(lián)用阿霉素與單用阿霉素組相比，細(xì)胞內(nèi)ATP水平無顯著差異（P>0.05）；③Westernblot顯示PARP抑制

10、劑ANI聯(lián)合阿霉素處理NCI-H929細(xì)胞，靶細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)下降；能量抑制劑Oligomycin也抑制自噬；MP則促進(jìn)LC3-II的表達(dá)。
　　結(jié)論：1、阿霉素能夠呈劑量依賴性誘導(dǎo)MM細(xì)胞死亡，凋亡為其主要通路；2、阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞損傷可激活PARP酶的作用，聚ADP核糖基化作用被激活；3、阿霉素誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬，進(jìn)而高表達(dá)ATP，以保護(hù)細(xì)胞；4、PARP抑制劑ANI的非抑制濃度聯(lián)合阿霉素，可抑制自