高糖致胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制及年齡相關(guān)胰島β細(xì)胞再生的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，2011年全球糖尿病患病人數(shù)為3.66億，預(yù)計(jì)2030年將達(dá)到5.52億，相當(dāng)于每十秒鐘增加一名糖尿病患者。在我國，糖尿病患病率正處于激增階段，近10年翻了近兩倍，目前我國已成為全球第一糖尿病大國。糖尿病伴隨極高的致殘率和致死率，據(jù)統(tǒng)計(jì)每7秒鐘就有1人因糖尿病死亡，由于糖尿病可導(dǎo)致嚴(yán)重的血管并發(fā)癥，患者的生活質(zhì)量極差。糖尿病的防治迫在眉睫。糖尿病患者中90％以上屬于2型糖尿病，經(jīng)典理

2、論認(rèn)為，胰島β細(xì)胞功能衰竭和胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，既往的研究也多集中于α，β等胰島內(nèi)分泌細(xì)胞，但最新的研究表明，胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞在糖尿病發(fā)病過程中也起到重要的作用。
　　 胰島是高度血管化的組織，胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞是胰島微血管的主要組分，襯覆于血管內(nèi)壁，是機(jī)體與β細(xì)胞對(duì)話的“橋梁”。胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞與胰島β細(xì)胞的關(guān)系密切:1.β細(xì)胞分泌VEGF-A促進(jìn)胰島微血管形成2.β細(xì)胞代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)胰島微循環(huán)3.胰島微血

3、管內(nèi)皮細(xì)胞參與β細(xì)胞的分化發(fā)育與增殖4.胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞供給胰島β細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣5.胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)胰島β細(xì)胞炎癥反應(yīng)。介于胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞在胰島組織的生理學(xué)及病理學(xué)中的重要作用，內(nèi)皮細(xì)胞極有可能是高糖損傷胰島功能的靶標(biāo)之一。
　　 新近的研究發(fā)現(xiàn)，7周齡的糖尿病大鼠胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞增厚，內(nèi)皮窗孔消失;12周齡時(shí)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目顯著下降，出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞破裂及胰島內(nèi)出血;15周齡時(shí)，胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞無法遷移，同

4、時(shí)出現(xiàn)明顯的導(dǎo)管細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，提示高糖對(duì)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有損傷作用及致凋亡作用。胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能參與了糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程，但高糖導(dǎo)致胰島微血管內(nèi)皮凋亡的具體機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步探索。
　　 糖尿病是一種以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。既往研究報(bào)道適量的一氧化氮(NO)是維持血管正常收縮、舒張功能的關(guān)鍵因子，但在高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)升高，進(jìn)而引起過量NO生成，NO進(jìn)一步氧化生成

5、過氧化亞硝酸鹽產(chǎn)物，造成內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致凋亡。高血糖可以通過氧化應(yīng)激激活JNK通路、Akt通路引起大血管內(nèi)皮及微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但對(duì)于胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究比較匱乏。最近有研究報(bào)道高糖可以引起人胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而用普伐他汀干預(yù)可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路減少內(nèi)皮凋亡，進(jìn)而改善血管功能。2012年，這個(gè)研究小組又報(bào)道了exendin-4可以通過PI3K/Akt、ERK1/2及cAMP/PKA等抗凋亡途徑，減少人胰

6、島微血管內(nèi)皮細(xì)胞在高糖刺激下的凋亡。高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡涉及多種機(jī)制，其相關(guān)凋亡通路主要為促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路。MAPK家族包括4個(gè)家族成員:細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)，p38和ERK5，他們在各種不同的刺激下激活，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理及病理過程。此前的研究表明，高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與JNK的激活密切相關(guān)。然而，該分子途徑是否參與高血糖引起的胰島微血

7、管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡尚不明確。
　　 本課題擬圍繞高糖致胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡展開研究，研究目的包括:
　　 1.以小鼠胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MS-1細(xì)胞）為研究對(duì)象，探討高糖對(duì)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　 2.使用JNK抑制劑、iNOS抑制劑干預(yù)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞，探討高糖引起胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　 研究方法
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)、分組
　　 MS-1細(xì)胞（小鼠胰島微血管

8、內(nèi)皮細(xì)胞）用正常濃度葡萄糖(5.5mmol/l葡萄糖)、甘露醇(5.5mmol/l葡萄糖+24.5mmol/l甘露醇)或高糖(30mmol/l葡萄糖)刺激7天。按需要加入SP600125(JNK抑制劑，30μmol/l)或1400W(iNOS抑制劑，20μmol/l)預(yù)刺激1小時(shí)，再進(jìn)行高糖刺激。
　　 2.Hoechst33258染色
　　 將細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板內(nèi)，刺激結(jié)束后用Hoechst33258染色，共聚焦顯微鏡

9、下觀察凋亡細(xì)胞核的改變，并測凋亡率。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測凋亡
　　 將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板內(nèi)，刺激結(jié)束后使用annexin-V-PI染色，使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。
　　 4.Caspase-3活性檢測
　　 使用Caspase-3活性檢測試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行。
　　 5.ROS及O2-的檢測
　　 ROS
　　 將細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板內(nèi)，刺激結(jié)束后用DCFH-D

10、A孵育，共聚焦顯微鏡拍照，通過熒光相對(duì)強(qiáng)度評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。
　　 O2-
　　 將細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板內(nèi)，刺激結(jié)束后用dihydroethidium(O2-的熒光探針)孵育，共聚焦顯微鏡拍照，通過熒光相對(duì)強(qiáng)度評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)O2-的水平。
　　 6.免疫熒光染色
　　 細(xì)胞種植在圓形玻片上，刺激結(jié)束后，用4％多聚甲醛固定，0.03％TritonX-100透膜，10％胎牛血清封閉，一抗過夜后加入二抗。共聚焦

11、顯微鏡下立即觀察、拍照。
　　 7.Westernblot
　　 細(xì)胞刺激結(jié)束后提取蛋白，上樣后跑膠，牛奶封閉，一抗孵育過夜，二抗后加入顯影劑顯影、定影。
　　 8.NO的測定
　　 使用總NO檢測試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.抑制JNK或iNOS可以減少高糖引起的MS-1細(xì)胞凋亡
　　 流式細(xì)胞儀及Hoechst33258染色檢測顯示，高糖組的細(xì)胞

12、凋亡率與正常糖組相比有顯著性差異;而滲透壓對(duì)照組與正常糖組相比無顯著性差異。
　　 使用JNK抑制劑SP600125(30μmol/l)和iNOS抑制劑1400W(20μmol/l)干預(yù)高糖下的MS-1細(xì)胞，SP600125及1400W可以顯著降低高糖引起的MS-1細(xì)胞凋亡。
　　 2.抑制JNK或iNOS可以減少高糖刺激下MS-1細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)，減少NO、氧化亞硝酸鹽的生成
　　 Westernblot

13、及細(xì)胞免疫熒光染色顯示高糖組與正常糖組相比較，iNOS蛋白的表達(dá)及氧化亞硝酸鹽生成顯著升高。SP600125干預(yù)或1400W干預(yù)均可使高糖刺激下iNOS蛋白的表達(dá)顯著下降，同時(shí)氧化亞硝酸鹽生成顯著減少。
　　 檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)基中的總NO生成量。結(jié)果顯示NO的生成呈時(shí)間依賴性，在48h時(shí)，高糖組與正常糖組相比有顯著性差異。同時(shí)，SP600125干預(yù)組及1400W干預(yù)組的NO生成量與iNOS表達(dá)量相一致，與高糖組相比均有顯著性差異

14、。
　　 3.高糖可以增加MS-1細(xì)胞中ROS及O2-的產(chǎn)生
　　 與正常糖組相比較，高糖可以顯著增加MS-1細(xì)胞中ROS及O2-的產(chǎn)生，但滲透壓對(duì)照組無明顯差異。
　　 4.抑制JNK通路可以通過下調(diào)iNOS的表達(dá)減少高糖下MS-1細(xì)胞的凋亡
　　 Westernblot及細(xì)胞免疫熒光染色顯示在高糖刺激下，MS-1細(xì)胞中的P-JNK蛋白水平顯著增高，但T-JNK蛋白水平無明顯變化。SP600125及14

15、00W可以顯著減少JNK的磷酸化以及MS-1細(xì)胞的凋亡。
　　 5.高糖通過激活JNK通路調(diào)節(jié)bax、bal-2的蛋白表達(dá)
　　 Westernblot顯示高糖下MS-1細(xì)胞中bax蛋白表達(dá)顯著增加，但bcl-2蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯的改變。bax蛋白表達(dá)的增加可以被SP600125所抑制。此外高糖刺激下bax與bcl-2的比值顯著升高，但可以被SP600125所抑制。
　　 6.高糖通過激活JNK通路調(diào)節(jié)clea

16、vedcaspase-3和cleavedPARP的蛋白表達(dá)
　　 Westernblot結(jié)果顯示高糖下cleavedcaspase-3蛋白和cleavedPARP蛋白表達(dá)顯著升高。而JNK的抑制劑SP600125可以通過抑制JNK通路的激活而抑制這種改變。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.高糖可以導(dǎo)致MS-1細(xì)胞凋亡。
　　 2.高糖通過活性氮自由基(RNS)啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡途徑引起MS-1細(xì)胞凋亡。
　

17、　 3.JNK通路參與調(diào)控高糖-RNS導(dǎo)致的MS-1細(xì)胞凋亡。
　　 研究意義：
　　 通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)高糖對(duì)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MS-1)存在致凋亡作用。通過抑制JNK通路，可以顯著降低高糖下胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率，改善了胰島微血管的結(jié)構(gòu)和功能，間接改善胰島的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣的供應(yīng)，更好的完成機(jī)體與胰島對(duì)話的“橋梁”作用。介于胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞在胰島組織的生理學(xué)及病理學(xué)中的重要作用，內(nèi)皮細(xì)胞極有可能是高糖損傷胰