鈣非依賴型磷脂酶A-,2-對間歇性高糖誘導(dǎo)的大鼠胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、隨著近年來對胰島糖毒性研究的不斷進(jìn)展，氧化應(yīng)激受到了更多學(xué)者的關(guān)注。高糖導(dǎo)致活性氧簇（ROS）生成增多，氧化應(yīng)激成為細(xì)胞損傷的共同土壤。如何避免或修復(fù)因ROS增多導(dǎo)致的胰島血管內(nèi)皮損傷，對于維持胰島微循環(huán)的正常運(yùn)行從而最終延緩胰島細(xì)胞本身功能的衰竭及抗損傷能力具有重要的意義。 磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一個包含多種不同亞型的蛋白超家族，具有水解甘油磷酸酯sn-2位脂肪酸能力的特性。PLA2超家族根

2、據(jù)其生化特性的不同，主要分為以下四種類型，即：1．鈣依賴型分泌型磷脂酶A2（sPLA2）；2．鈣依賴型胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）；3．鈣非依賴型磷脂酶A2（iPLA2）；4．血小板活化因子乙?；饷福≒AF-AH）。iPLA2是Ⅵ型PLA2，作為一組重要的PLA2亞型，它具有分解膜磷脂sn-2脂肪酰鍵、釋放出游離脂肪酸和溶血磷脂，后者作為受體結(jié)合花生四烯酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為膜磷脂，與磷脂重塑密切相關(guān)。iPLA2抑制劑BEL或iPLA2的

3、反義寡核苷酸均可抑制溶血磷脂酰膽堿的形成，抑制花生四烯酸結(jié)合到膜磷脂上，因此iPLA2可能參與了細(xì)胞生物膜磷脂的重塑，尤其是對線粒體膜具有重要的膜修復(fù)功能。由于線粒體內(nèi)膜富含心磷脂，且十分靠近活性氧的生成部位，極易受到活性氧的攻擊。有研究顯示iPLA2主要定位于線粒體，通過轉(zhuǎn)染使其高表達(dá)于胰島細(xì)胞株INS-1上，能夠緩解線粒體膜損傷。細(xì)胞本身具有氧化-抗氧化的平衡能力，其具有利用自身天然的脂肪酸修復(fù)或清除膜上過氧化的脂肪酸殘?bào)w，這一過程

4、需要PLA2超家族成員的參與。iPLA2可以通過乙?；蝗ヒ阴；h(huán)參與膜磷脂的重塑和修復(fù)的初始過程。 iPLA2具有多種生物學(xué)功能，尤其是在膜磷脂重塑方面可能成為防治細(xì)胞損傷的新靶點(diǎn)。分子生物學(xué)檢測方法日益更新，在間歇性高糖對微血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究中，探尋iPLA2是否參與這一病理生理過程，可以進(jìn)一步了解iPLA2的作用功能及機(jī)制，并為疾病的發(fā)生及治療研究展示廣闊的前景。 目的: 本課題擬通過純化大鼠胰島獲得I

5、MECs，通過間歇性高糖誘導(dǎo)，觀測其對IMECs的毒性作用。初步探討iPLA2在間歇性高糖誘導(dǎo)下的病理改變及對大鼠IMECs凋亡的作用機(jī)制。 內(nèi)容: 課題分以下三個部分： 一、大鼠IMECs的純化、鑒定及培養(yǎng) 目的: 建立高效的大鼠IMECs分離純化方法。 方法: 1．大鼠胰島的分離純化及鑒定 取成年Wistar大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，0．8g/L膠原酶P灌注胰腺

6、進(jìn)行消化分離。消化后通過Ficoll不連續(xù)密度梯度液純化胰島。DTZ染色鑒定胰島及臺盼藍(lán)檢測純度。 2．大鼠IMECs的純化 分離純化的大鼠胰島培養(yǎng)于內(nèi)皮細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基，待IMECs從胰島周邊爬出后，使用UEA-1包被的免疫磁珠對IMECs進(jìn)行純化。 3．大鼠IMECs的鑒定 免疫熒光法檢測經(jīng)典的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物第Ⅷ因子相關(guān)抗原（vWF）、CD34的表達(dá)和吞噬Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-Ac-

7、LDL）的能力。 4．大鼠IMECs的培養(yǎng) 純化后的細(xì)胞接種在2%明膠包被的T25培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。每2～3天換1次內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至完全匯合時，進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞傳至第5～6代后增殖較快，可用于實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果: 大鼠胰腺純化前平均可獲取434±39胰島當(dāng)量（islet equivalent，IEQ）的胰島，純化后可獲取265±45IEQ，純度為（86±5．42）%。純化

8、所得大鼠胰島經(jīng)培養(yǎng)3天后貼壁，5～6天可見IMECs從胰島周邊爬出，7～9天細(xì)胞逐漸融合成片。經(jīng)UEA-1包被的免疫磁珠與大鼠IMECs選擇性結(jié)合，用磁力分離器收集后得到高純度的內(nèi)皮細(xì)胞。懸浮于培養(yǎng)液中，1h后大部分細(xì)胞貼壁，6h后大部分伸展，5天后細(xì)胞能增殖，鋪滿再傳代，具有單層生長和接觸抑制的特性。擴(kuò)增培養(yǎng)至第5代時細(xì)胞上基本沒有磁珠存在。使用免疫熒光檢測試劑盒檢測磁珠純化后的IMECs，結(jié)果顯示分離純化后的IMECs表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的

9、標(biāo)志分子vWF、CD34，并具有攝取Dil-Ac-LDL的能力。 結(jié)論: 成功建立了大鼠IMECs的分離純化方法。 二、間歇性高糖對大鼠IMECs氧化應(yīng)激的影響 目的: 探討間歇性高糖對大鼠IMECs氧化應(yīng)激的影響及相關(guān)機(jī)制。 方法: 1．實(shí)驗(yàn)分組 正常葡萄糖組：加入5mmol/L葡萄糖濃度的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液；恒定性高糖組：加入28mmol/L糖濃度的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液；

10、間歇性高糖組：每24h輪換加入5mmol/L或28mmol/L糖濃度的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。每組各3個培養(yǎng)孔，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 2．DNA片段化檢測IMECs凋亡 采用DNA ladder試劑盒檢測各組細(xì)胞，DNA產(chǎn)物于1．5%的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)照相。 3．AnnexinⅤ/PI流式檢測IMECs凋亡率 按AnnexinⅤ/PI凋亡試劑盒說明書要求處理細(xì)胞后，經(jīng)流式細(xì)胞儀利用

11、FL1和FL3雙通道波長檢測。 4．IMECs凋亡蛋白酶caspase-3活性的檢測 按caspase-3試劑盒說明書處理細(xì)胞后，采用連續(xù)光譜熒光儀檢測各反應(yīng)孔的熒光強(qiáng)度。 5．IMECs中ROS濃度的檢測 吸盡孔中培養(yǎng)液后，按照試劑盒說明書依次添加試劑，經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。 6．IMECs中黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）含量的檢測 按XOD檢測試劑盒說明書先配

12、制試劑后處理各組細(xì)胞，用酶標(biāo)儀在550nm波長讀取每孔的OD值。 7．IMECs線粒體膜電位的檢測 配置DIOC6（3）工作液后與IMECs共孵育，經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS11．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x+s）表示，第二章統(tǒng)計(jì)方法全部采用單向方差分析，兩兩比較采用LSD法，P<0．050具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 本研究觀測到恒定性高糖及間歇性高糖均促進(jìn)IM

13、ECs發(fā)生凋亡，間歇性高糖對IMECs凋亡的誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。與恒定性高糖比較，間歇性高糖培養(yǎng)條件下，caspase-3酶活性增高更加顯著，IMECs黃嘌呤氧化酶含量增高更為明顯，ROS產(chǎn)生更多，線粒體膜電位明顯下降。間歇性高糖比持續(xù)性高糖對IMECs的氧化應(yīng)激損傷更大，可能是其導(dǎo)致凋亡增多的機(jī)制之一。 三、鈣非依賴型磷脂酶A2對間歇性高糖誘導(dǎo)的大鼠胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 目的: 通過小分子RNA干擾技術(shù)抑制I

14、MECs中iPLA2的表達(dá)，初步探討其對間歇性高糖誘導(dǎo)的IMECs凋亡的影響。 方法: 1．RT-PCR檢測IMECs的iPLA2 mRNA表達(dá) 分別用正常糖、恒定性高糖和間歇性高糖誘導(dǎo)IMECs7天后，依次進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA和PCR實(shí)驗(yàn)。PCR產(chǎn)物在1．5%的瓊脂糖凝膠電泳顯示。 2．iPLA2的siRNA的合成及轉(zhuǎn)染 iPLA2雙股RNA干擾序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有

15、限公司合成，陰性對照RNA干擾序列為不與大鼠mRNA同源的基因。應(yīng)用RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果。 3．凋亡檢測 用DNA ladder和流式細(xì)胞儀檢測iPLA2表達(dá)抑制后IMECs在間歇性高糖條件下凋亡的情況。（方法同第二章） 4．線粒體膜電位的檢測：抑制iPLA2表達(dá)后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測間歇性高糖條件下IMECs的線粒體膜電位的變化。（方法同第二章） 5．檢測細(xì)胞ROS生成情況。（方法同第二章）

16、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS11．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析．?dāng)?shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，第三章統(tǒng)計(jì)方法采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，其中兩兩比較采用t檢驗(yàn)，三組比較采用單向方差分析。P<0．050具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 間歇性高糖及恒定性高糖均能誘導(dǎo)IMECs凋亡，并不同程度的影響到iPLA2mRNA的表達(dá)，間歇性高糖的抑制作用最強(qiáng)。在間歇性高糖培養(yǎng)條件下，通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制iPLA2的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)了IMECs內(nèi)