模擬失重對肺微血管內皮細胞的影響.pdf

1、目的：
　　 失重或模擬失重可導致肺循環(huán)功能失調，血管結構、功能的變化在其中具有重要作用。肺微血管內皮細胞功能對于肺循環(huán)的正常功能維持具有重要作用，是構成微血管通透性的主要物理屏障，不僅能保證微血管內外正常的物質交換，而且可分泌多種因子調節(jié)微血管的舒縮功能。失重或模擬失重后肺微血管內皮細胞結構、功能變化及其內在機制并不清楚。因此，本課題的目的為：
　　 （1）觀察回轉模擬失重對肺微血管內皮細胞超微結構的影響：
　　

2、 （2）研究回轉模擬失重對肺微血管內皮細胞合成NO產量及eNOS蛋白表達的影響；
　　 （3）研究回轉模擬失重對肺微血管內皮細胞骨架的影響；
　　 （4）研究回轉模擬失重對肺微血管內皮細胞凋亡的影響初步分子機制。
　　 方法
　　 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代肺微血管內皮細胞，以倒置相差顯微鏡、Ⅷ因子免疫熒光染色、掃描電鏡和透射電鏡等方法對培養(yǎng)的肺微血管內皮細胞進行鑒定；采用回轉器回轉細胞模擬失重，以掃描電

3、鏡和透射電鏡法對回轉模擬失重后肺微血管內皮細胞的超微結構變化進行觀察：以Griess法對培養(yǎng)的肺微血管內皮細胞合成釋放的NO濃度進行檢測，以免疫組化技術和Western blot技術對肺微血管內皮細胞中的eNOS蛋白表達進行檢測：以Annexin V-FITC和PI雙染標記細胞，采用流式細胞術及Hoechst33258細胞核染色對肺微血管內皮細胞凋亡進行檢測：采用免疫熒光標記技術，以Texas Red-X偶聯(lián)的phalloidin標記肺

4、微血管內皮細胞微絲肌動蛋白，觀察回轉模擬失重對肺微血管內皮細胞骨架的影響；采用放免技術檢測回轉模擬失重后肺微血管內皮細胞ET-1合成釋放量的變化，以Western blot技術和免疫熒光技術檢測肺微血管內皮細胞Akt磷酸化水平的變化及P21Cip1蛋白表達的變化；采用Western blot技術對凋亡調控蛋白Bcl-2和Bax的表達進行檢測。
　　 結 果
　　 掃描電鏡結果表明，回轉48h后，肺微血管內皮細胞單層細胞之

5、間的連接較為松散，可見有明顯的裂縫存在；而在同步對照組的肺微血管內皮細胞單層可見細胞之間的連接較為緊密，未見裂縫或空洞存在，說明回轉模擬失重能夠破壞肺微血管內皮細胞單層，導致肺微血管內皮細胞單層的通透性明顯增強。透射電鏡結果表明，回轉48小時后，可見肺微血管內皮細胞中線粒體增生、腫脹。NO檢測及Western blot、免疫組化結果表明，回轉模擬失重可導致肺微血管內皮細胞的NO產量增加，同時增強eNOS蛋白的表達，并且這種增加存在時間依

6、賴關系。Hoechst33258染色及流式細胞術檢測結果表明，回轉48h模擬失重肺微血管內皮細胞凋亡率明顯高于對照；phalloidin肺微血管內皮細胞微絲肌動蛋白染色結果表明，回轉模擬失重可導致微絲細胞骨架隨著回轉時間的延長出現(xiàn)進行性的解聚；回轉48h后，放免結果表明肺微血管內皮細胞合成釋放ET-1的量下降：Western blot及免疫熒光染色結果表明，Akt磷酸化水平下降，而P21Cip1蛋白表達增強：Western blot檢測

7、凋亡相關蛋白結果表明，回轉模擬失重后肺微血管內皮細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下降，而促凋亡蛋白Bax表達顯著升高。
　　 結 論
　　 （1）回轉模擬失重可導致肺微血管內皮細胞中線粒體增生、腫脹：破壞肺微血管內皮細胞單層，導致肺微血管內皮細胞單層的通透性明顯增強；
　　 （2）回轉模擬失重可刺激肺微血管內皮細胞中NO的合成和釋放，增強eNOS蛋白的表達，并且這種eNOS表達的增強和NO產量的增加與回轉模擬失