Ghrelin對高糖誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響及其作用機制的研究.pdf

1、本實驗探討ghrelin對于高濃度葡萄糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響及其可能的作用機制，期望能對ghrelin功能的深入研究做出一點貢獻。 方法： 1、細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV304)在低糖DMEM培養(yǎng)基和10％胎牛血清中于37℃、5％CO2條件下進行培養(yǎng)，隔天換液，將傳至4-5代的細胞用于實驗。當(dāng)細胞呈對數(shù)生長后，調(diào)整細胞數(shù)為1×106/L，接種于6孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，待細胞生長至融合狀態(tài)后用無血清培

2、養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細胞呈靜止?fàn)顟B(tài)，更換實驗用液隨機分配為實驗組及對照組進行實驗。 2、吖啶橙(Acridine Orange，AO)和Hoechst33258熒光染色各組細胞按不同實驗條件處理后，加入0.01％AO及100μL Hoechst33258工作液染色，熒光顯微鏡下觀察。 3、流式細胞儀分析凋亡收集實驗各組細胞，70％酒精固定過夜，1000rpm/min離心10min，棄上清，加PBS洗二次，棄上清，吹打管底，加

3、入1000μg/L碘化丙錠(PI)500μL，4℃避光放置30min，流式細胞儀上樣檢測，CellQuest 3.0采集細胞，MedFit LT 3.0軟件分析細胞周期。 4、TUNEL檢測凋亡各組細胞按不同實驗條件處理后，收集各組細胞，制成細胞涂片，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗三次，按TUNEL試劑盒操作：標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液18μl/片，加TdT和DIG-d-DTP各1μl，濕盒37℃孵箱中標(biāo)記2h，0.01mol/L

4、 TBS洗2min×3次，加封閉液50 μl/片，室溫30min，抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體，50μl/片加至標(biāo)片上，置濕盒37℃反應(yīng)30min，0.01mol幾TBS洗2min×3次，抗體稀釋液1：100稀釋SABC，混勻后50μl/片，37℃反應(yīng)30min，0.01mol/L TBS洗5min×4次，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，沖洗，封片，顯微鏡下觀察細胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細胞，結(jié)果用MetaMorph/DP

5、10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)分析，以每片取5個最強的染色區(qū)域，400倍鏡下計數(shù)各區(qū)域陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算出每區(qū)域陽性細胞百分比，即凋亡指數(shù)，以5個區(qū)域凋亡指數(shù)的平均值作為每組的凋亡指數(shù)。每組選取5張代表涂片計數(shù)，計數(shù)結(jié)果平均值作為各組凋亡百分率。 5、分光光度計檢測caspase-3活性各組細胞按不同實驗條件處理后，收集各組細胞，PBS洗二次，2000rpm/min離心5min，去除PBS，沉淀細胞中加入50μl冰冷裂解

6、液和0.5μL DTT，吹打，冰上裂解60min，期間渦旋4次，每次10s，4℃10000rpm/min離心1min，吸取上清至新管中置冰上，測蛋白濃度，各組采用同樣蛋白量進行實驗，加50μL 2×Reaction Buffer/DTTMix，加5μL caspase-3 substrate(Ac-DEV-pNA)，37℃4h。分光光度計在400nm波長測定其吸光值，計算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對照確定各組caspase-3活化程度。

7、 6、流式細胞儀分析ROS實驗各組細胞培養(yǎng)結(jié)束后用無血清培養(yǎng)基洗二次，加入HBSS稀釋的DCFH-DA(2μmol/L)熒光探針37℃繼續(xù)孵育20min，DCFH-DA可穿過細胞膜進入細胞，在胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成DCFH，在活性氧存在的條件下被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，以細胞內(nèi)平均熒光強度反應(yīng)活性氧水平，培養(yǎng)結(jié)束后冰PBS洗脫二次，收集細胞，流式細胞儀進行分析。 7、Western-Blot分析磷酸化AKT(Ser473)、NF-κB(p

8、65)蛋白表達實驗細胞用冰PBS洗二遍，細胞刷收集細胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒操作分別提取各組細胞總蛋白及核蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度，每組蛋白質(zhì)樣本40μg在100℃下變性5min，進行10％SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后5％脫脂奶粉封閉2h，洗膜后加入5％BSA-TBS稀釋的抗磷酸化AKT(Ser473)多克隆抗體(1：200)、抗NF-κB(P65)單克隆抗體(1：1000)4℃孵育過夜，再次洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗

9、(1：5000)雜交2h，洗膜后ECL超敏發(fā)光液進行顯色，每組重復(fù)3次，用同樣的方法顯示內(nèi)參β-actin條帶，結(jié)果用Scion Image分析軟件對目的條帶進行灰度值分析。 8、統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)表示，每組實驗重復(fù)3次或3次以上，分析方法采用單因素方差分析，S-N-K法兩兩比較，p<0.05差異有顯著性。 結(jié)果： 1、相差顯微鏡下見正常人臍靜脈內(nèi)

10、皮細胞呈單層生長，呈短梭狀或鵝卵石狀貼壁緊密排列，細胞為多角形，吖啶橙染色熒光顯微鏡下觀察細胞在正常濃度葡萄糖中培養(yǎng)72h細胞核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，呈均勻熒光；高糖組(33.3mmol/L)可見凋亡細胞，由于失去膜整合性、染色質(zhì)凝聚和核裂解，胞核致密濃染，呈多種形態(tài)；Ghrelin(10-7mol/L)預(yù)處理組染色質(zhì)凝聚、核裂解、致密濃染的細胞較高糖組明顯減少。Hoechst 33258熒光染色也得出相同結(jié)果。 2、流式細胞儀分析凋

11、亡，與對照組相比，高糖(33.3mmol/L)培養(yǎng)72h后增加內(nèi)皮細胞凋亡率(p<0.05)，而ghrelin(10-7mol/L)預(yù)處理24h后加入高糖(33.3mmol/L)作用72h，與高糖組比較凋亡率明顯下降(p<0.05)。 3、TUNEL檢測凋亡結(jié)果，與對照組相比，高糖(33.3mmol/L)培養(yǎng)72h后增加內(nèi)皮細胞凋亡率(p<0.05)，而ghrelin(10-7mol/L)預(yù)處理24h后加入高糖(33.3mmol

12、/L)作用72h，與高糖組比較凋亡率明顯下降(p<0.05)。 4、高糖(33.3mmol/L)呈時間依賴方式(24h-72h)誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞caspase-3活性增加，用ghrelin(10-7mol/L)預(yù)處理24h，高糖(33.3mmol/L)繼續(xù)作用(24h-72h)，結(jié)果ghrelin預(yù)處理組與未預(yù)處理組比較caspase-3活性減低(p<0.01)。加入P13-Kinase特異性抑制劑LY294002(20μmol/L

13、)及ghrelin(10-7mol/L)作用24h，高糖(33.3mmol/L)繼續(xù)作用72h，結(jié)果加抑制劑組與未加抑制劑組比較caspase-3活性增高(p<0.05)。 5、內(nèi)皮細胞用或不用ghrelin(10-7mol/L)預(yù)處理24h后，高糖(33.3mmol/L)繼續(xù)作用24h、48h，結(jié)果與對照組相比，高糖組細胞內(nèi)ROS分別增加27％、35％(p<0.05)，ghrelin預(yù)處理組細胞內(nèi)ROS分別增加11％、14％，

14、預(yù)處理組比高糖組細胞內(nèi)ROS明顯減少(p<0.05)。 6、不同濃度ghrelin(10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L)作用內(nèi)皮細胞30min后磷酸化AKT蛋白表達增加(與對照組比較，p<0.05)，但后三者之間無差異(p>0.05)；ghrelin(10-7mol/L)分別作用內(nèi)皮細胞0min、10min、30min、60min、120min，磷酸化AKT蛋白在ghrelin作用30

15、min后表達達高峰(與對照組比較，p<0.01)。 7、高糖(33.3mmol/L)作用內(nèi)皮細胞(6h-24h)與對照組比較NF-KB(p65)蛋白表達逐漸增加(p<0.05)，ghrelin(10-7mol／L)作用內(nèi)皮細胞6h未見明顯NF-KB(p65)蛋白表達，ghrelin(10-7mol/L)加高糖(33.3mmol/L)作用24h較未加ghrelin組比較NF-KB(p65)蛋白表達下降(p<0.05)。 結(jié)

16、論： 1、高濃度葡萄糖作用內(nèi)皮細胞72h使細胞凋亡增加，ghrelin可以減少高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡。 2、隨著作用時間延長(24h-72h)高濃度葡萄糖使內(nèi)皮細胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3活性增加，ghrelin可以抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的caspase-3活性增加。 3、高濃度葡萄糖作用內(nèi)皮細胞(24h-48h)可以使ROS表達增加，ghrelin可以減少高濃度葡萄糖導(dǎo)致的ROS增加。 4、