PGC-1α在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與凋亡中的作用機(jī)制.pdf

1、研究目的:
　　本研究旨在利用攜帶有PGC-1α的小片段干擾核糖核酸的腺病毒(adenovirus encoding a small hairpinRNA of PGC-1α，Ad-shPGC-1α)降調(diào)節(jié)PGC-1α的表達(dá)，探討PGC-1α與高糖環(huán)境誘導(dǎo)下人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與凋亡的關(guān)系,并就其可能作用機(jī)制做系列深入研究，以期更好的了解糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制，為早期預(yù)防糖尿病血管病變提供理論依據(jù)。
　　研究方法:

2、r>　　1.細(xì)胞培養(yǎng)與處理:在無(wú)菌條件下，取通過(guò)剖宮產(chǎn)手術(shù)出生，健康產(chǎn)婦的足月新生兒的臍帶，收集臍帶內(nèi)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)并在適宜條件下培養(yǎng)傳代，取38代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為建立恰當(dāng)?shù)奶悄虿◇w外實(shí)驗(yàn)條件，首先將培養(yǎng)的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分為基礎(chǔ)條件細(xì)胞組（對(duì)照組）（M199加全培養(yǎng)基含5.5mmol/L葡萄糖、20％FBS、2％L-谷氨酰胺、1

3、00U/ml青鏈霉素雙抗）、甘露醇組(甘露醇25mmol/L)、11mmol/L葡萄糖處理組，15mmol/L葡萄糖處理組及25mmol/L葡萄糖處理組共五組細(xì)胞，分別孵育48小時(shí);再選擇最佳葡萄糖濃度下孵育細(xì)胞12、24、48、72、96小時(shí)。用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖，蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)PGC-1α蛋白表達(dá)。
　　2.探究下調(diào)PGC-1α對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響。(1)用攜帶PGC-1α

4、的小片段干擾核糖核酸的腺病毒(Ad-shPGC-1α)轉(zhuǎn)染臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而下調(diào)PGC-1α，用攜帶無(wú)效片段的PGC-1α小片段干擾核糖核酸的腺病毒(control shRNA，Ad-Scr)轉(zhuǎn)染臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞作為對(duì)照，轉(zhuǎn)染條件為感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)分別為10、20、40，轉(zhuǎn)染24小時(shí)。轉(zhuǎn)染后分別用Western Blot及實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-t

5、ime PCR，qPCR)檢測(cè)PGC-1α蛋白表達(dá)及mRNA水平。(2)Ad-shPGC-1α及Ad-Scr分別轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)條件細(xì)胞組及高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞，用CCK8法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖（實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、Ad-Scr轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)條件細(xì)胞組及轉(zhuǎn)染高糖誘導(dǎo)組、Ad-shPGC-1α轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)條件細(xì)胞組及轉(zhuǎn)染高糖誘導(dǎo)組）;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，使用的試劑盒為FITC-AnnexinⅤ/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。
　　3.探明

6、下調(diào)PGC-1α對(duì)線(xiàn)粒體內(nèi)膜通透性及膜電位的影響。(1)用鈣黃綠色染色法(Calcein-AM)檢測(cè)線(xiàn)粒體內(nèi)膜通透性:將Calcein-AM探針和CoCl2與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10min，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)絀胞，并用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀分析熒光密度;(2)用JC-1染色法檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位:將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與JC-1染料于37℃環(huán)境內(nèi)孵育15min。用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，并用ImageJ軟件分析其熒光強(qiáng)

7、度。線(xiàn)粒體膜去極化的程度用紅光與綠光的比值來(lái)衡量。（實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、轉(zhuǎn)染Ad-shPGC-1α高糖誘導(dǎo)組、轉(zhuǎn)染Ad-Scr高糖誘導(dǎo)組）
　　4.進(jìn)一步探明下調(diào)PGC-1α對(duì)線(xiàn)粒體膜通透性的影響。檢測(cè)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞色素C(Cytochrome c，Cyt c)釋放和半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)活性的改變。用Western Blot分別檢測(cè)了細(xì)胞線(xiàn)粒體及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Cyt c蛋白表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)Caspase-

8、3及Caspase-9的蛋白表達(dá)（實(shí)驗(yàn)分組:同3）。
　　研究結(jié)果:
　　1.在不同葡糖糖濃度下孵育48小時(shí)后的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，甘露醇組與對(duì)照組細(xì)胞增殖相同，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。不同高糖濃度處理下的各組細(xì)胞增殖均有降低，與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，在15mmol/L葡萄糖處理組降低最明顯;實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在15mmol/L葡萄糖濃度下孵育12，24，48，72和96小時(shí)后，在24，48，72和96小時(shí)組細(xì)胞增殖均

9、有降低，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，在孵育48小時(shí)組細(xì)胞增殖降低最明顯。
　　2.下調(diào)PGC-1α對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　(1)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞被Ad-shPGC-1α轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示，不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，PGC-1α蛋白表達(dá)及mRNA水平均有降低，與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，在感染復(fù)數(shù)為20條件下，PGC-1α蛋白表達(dá)及mRNA水平降低最明顯;同時(shí)用Ad-S

10、cr轉(zhuǎn)染的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)PGC-1α的蛋白表達(dá)及mRNA水平改變，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　(2)用CCK-8法檢測(cè)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在未經(jīng)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染Ad-shPGC-1α或Ad-Scr后，均未見(jiàn)細(xì)胞增殖的下降，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05);而高糖誘導(dǎo)細(xì)胞組，細(xì)胞增殖明顯降低，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉(zhuǎn)染Ad-shPGC-1α的高

11、糖誘導(dǎo)組，細(xì)胞增殖進(jìn)一步降低，與高糖誘導(dǎo)組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉(zhuǎn)染Ad-Scr的高糖誘導(dǎo)組，細(xì)胞增殖明顯降低，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與高糖誘導(dǎo)組比較細(xì)胞增殖無(wú)變化(P＞0.05)。
　　3.下調(diào)PGC-1α對(duì)線(xiàn)粒體膜通透性及膜電位的影響。
　　(1)首先用鈣黃綠色染色法(Calcein-AM)檢測(cè)線(xiàn)粒體膜通透性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):單獨(dú)高糖誘導(dǎo)組的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，線(xiàn)粒體膜損傷，通透性增加，與Cal

12、cein-AM探針及CoCl2共同孵育后，膜內(nèi)綠色熒光被膜外的CoCl2淬滅，膜內(nèi)綠色熒光減少，熒光密度下降，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉(zhuǎn)染Ad-shPGC-1α高糖誘導(dǎo)細(xì)胞組線(xiàn)粒體膜損傷加重，膜內(nèi)綠色熒光進(jìn)一步減少，熒光密度進(jìn)一步降低，與高糖誘導(dǎo)組比較有顯著性差異(P＜0.01);而在轉(zhuǎn)染Ad-Scr高糖誘導(dǎo)組，膜內(nèi)綠色熒光減少，熒光密度下降，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與高糖誘導(dǎo)組比較無(wú)明顯變化(P＞0

13、.05)。
　　(2)用JC-1染色法檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位。用JC-1線(xiàn)粒體熒光探針?lè)跤龑?shí)驗(yàn)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)組線(xiàn)粒體基質(zhì)內(nèi)紅色熒光降低，同時(shí)綠色熒光增加，紅綠熒光的比值降低，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉(zhuǎn)染Ad-shPGC-1α高糖誘導(dǎo)組，紅色熒光進(jìn)一步減少，綠色熒光增加，紅綠熒光比值進(jìn)一步降低，與高糖誘導(dǎo)組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉(zhuǎn)染Ad-Scr高糖誘導(dǎo)組，紅綠熒光比值降低，與對(duì)照組比較有顯著性差

14、異(P＜0.01)，與高糖誘導(dǎo)組比較無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　4.進(jìn)一步探明下調(diào)PGC-1α對(duì)線(xiàn)粒體膜通透性的影響，檢測(cè)高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞色素c釋放和半胱氨酸蛋白水解酶Caspase活性的改變。Western Blot結(jié)果顯示，在高糖誘導(dǎo)細(xì)胞組，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)增加，與此同時(shí)，線(xiàn)粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c明顯減少，細(xì)胞質(zhì)與線(xiàn)粒體細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)比值升高，與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.01);轉(zhuǎn)染Ad-

15、shPGC-1α高糖誘導(dǎo)組，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)進(jìn)一步減少，細(xì)胞質(zhì)與線(xiàn)粒體細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)比值進(jìn)一步升高,與高糖誘導(dǎo)組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。在高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞Caspase-3及Caspase-9蛋白表達(dá)都明顯增加，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉(zhuǎn)染Ad-shPGC-1α的高糖誘導(dǎo)組，Caspase-3及Caspase-9蛋白表達(dá)增加更加明顯，與高糖誘導(dǎo)組比較有顯著性

16、差異(P＜0.01)。在轉(zhuǎn)染Ad-Scr高糖誘導(dǎo)組，細(xì)胞色素c及Caspase蛋白表達(dá)情況，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與高糖誘導(dǎo)組比較無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中，PGC-1α的表達(dá)與高糖環(huán)境下細(xì)胞增殖相關(guān);高糖誘導(dǎo)下的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖降低，同時(shí)PGC-1α表達(dá)降低。
　　2.下調(diào)PGC-1α?xí)M(jìn)一步降低高糖誘導(dǎo)下的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加重

17、高糖誘導(dǎo)下的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡;但是對(duì)正常環(huán)境下的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡無(wú)影響;
　　3.下調(diào)PGC-1α加重高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜損傷，膜通透性增加，線(xiàn)粒體膜電位去極化程度降低。
　　4.下調(diào)PGC-1α增加高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞色素c釋放和半胱氨蛋白水解酶活性，進(jìn)一步闡明下調(diào)PGC-1α加重線(xiàn)粒體膜通透性的改變。
　　5.下調(diào)PGC-1α導(dǎo)致的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加與Bcl