SIRT1在高糖培養(yǎng)人臍靜脈血管內皮細胞損傷中的作用.pdf

1、目的： 近期發(fā)現長壽蛋白SIRT1可改善肥胖大鼠的胰島素敏感性，降低血糖，改善動脈粥樣硬化。但SIRT1改善糖尿病的機制未明，其是否參與了2型糖尿病及其大血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展尚缺乏深入的研究。本研究以高糖培養(yǎng)原代人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）為研究對象，研究SIRT1在其損傷中的作用及可能的機制。 方法： 0.25%胰蛋白酶灌注消化法分離HUVEC細胞。取生長良好的第2～3代細胞用于實驗。實驗分4個部分。第1部分

2、：高糖對內皮細胞SIRT1表達及內皮細胞功能指標的影響。培養(yǎng)細胞分為正常對照組（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖培養(yǎng)組（33.3mmol/L葡萄糖）、甘露醇高滲對照組（5.5 mmol/L葡萄糖+27.8 mmol/L露醇）。細胞處理48小時。應用RT-PCR法檢測SIRT1、E-選擇素、eNOS、內皮素-1基因的表達情況，以Western印跡法檢測培養(yǎng)細胞SIRT1的蛋白水平，以硝酸還原酶法檢測培養(yǎng)細胞上清中NO的含量。第2部分：S

3、IRT1激動劑白藜蘆醇對高糖處理內皮細胞功能指標的影響。細胞分為正常對照組、高糖組、1μmol/L白藜蘆醇預處理24小時+高糖組。高糖處理48小時。分析指標及方法同第一部分。第3部分：白藜蘆醇對SIRT1基因“沉默”后高糖處理內皮細胞功能指標的影響。細胞分5組：正常對照組、高糖組、白藜蘆醇預處理+高糖組、SIRT1 siRNA+白藜蘆醇預處理+高糖組、Lipo2000+白藜蘆醇+高糖組（空載體組）。前3組細胞處理同第2部分。SIRT1

4、siRNA組細胞以Lipofectamine 2000脂質體為載體轉染16.7 nmol/LSIRT1 siRNA入內皮細胞，以干擾內皮細胞SIRT1的表達，干擾后6小時更換為正常培養(yǎng)液，24小時后進行后續(xù)的白藜蘆醇和高糖處理。空載體組單純以Lipofectamine2000脂質體處理內皮細胞，其余處理同SIRT1 siRNA組。分析指標及方法同第一部分。第4部分：白藜蘆醇對高糖處理內皮細胞胰島素抵抗的影響。培養(yǎng)細胞分為對照組、胰島素處

5、理組、高糖組+胰島素處理組、1μmol/L白藜蘆醇預處理24小時+高糖+胰島素處理組。高糖處理48小時。后3組細胞以100 nmol/L胰島素刺激30 min。檢測上清中內皮細胞NO分泌含量。 結果： （1）與正常對照相比，高糖培養(yǎng)48小時使內皮細胞SIRT1的mRNA及蛋白表達均降低（P<0.05）；內皮細胞eNOS mRNA的表達及NO分泌降低（P<0.01）；而反映內皮細胞損傷的因子如E-選擇素及內皮素-1的表達卻

6、明顯升高（P<0.05）。甘露醇組與正常對照相比沒有顯著差異。 （2）與高糖組相比，1μmol/L白藜蘆醇預處理24小時明顯升高高糖處理內皮細胞SIRT1的表達水平（P<0.01）；同時內皮細胞eNOS的表達（P<0.05）、NO分泌均明顯升高（P<0.01）；E-選擇素、內皮素-1明顯降低（P<0.05）。 （3）與單純白藜蘆醇處理組相比，SIRT1 siRNA組細胞SIRT1的mRNA及蛋白水平均顯著降低（P<0.0

7、5），SIRT1蛋白表達的干擾效率為45.9%；內皮細胞的eNOS表達、NO的分泌明顯降低（P<0.05），與高糖處理組沒有差異，提示隨SIRT1的表達“沉默”白藜蘆醇促進eNOS表達、NO分泌的作用“消失”；內皮素-1的表達沒有變化（P>0.05），均顯著低于高糖組，提示隨SIRT1的表達“沉默”白藜蘆醇對內皮素-1的抑制作用不受影響；E-選擇素的表達明顯升高（P<0.05），與高糖處理組差異不明顯，提示隨SIRT1的表達“沉默”白藜

8、蘆醇對E-選擇素的抑制作用也“消失”?？蛰d體組與白藜蘆醇處理組相比各指標無明顯差異。 （4）100 nmol/L胰島素處理30 min明顯刺激內皮細胞NO的分泌。高糖使內皮細胞胰島素刺激的NO分泌降低，產生了內皮細胞胰島素抵抗。但是白藜蘆醇預處理可以明顯促進高糖培養(yǎng)內皮細胞胰島素刺激的NO分泌。P均<0.01。 結論: （1）SIRT1通過促進eNOS表達及刺激NO分泌而具有舒張血管的作用，還通過抑制E-選擇素的

9、表達降低白細胞對內皮細胞的黏附。SIRT1的表達降低在高糖誘導的血管內皮細胞損傷中具有重要作用，SIRT1激動劑可保護內皮細胞不受高糖的影響，因而在預防和治療糖尿病大血管病變中具有廣闊的前景。 （2）白藜蘆醇可通過促進SIRT1的表達而具有促進高糖培養(yǎng)內皮細胞eNOS表達、NO分泌及降低E-選擇素表達的作用。白藜蘆醇還具有抑制內皮細胞內皮素-1表達的作用，且該作用與SIRT1無關。白藜蘆醇還具有改善高糖環(huán)境下內皮細胞胰島素抵抗的