Ghrelin對(duì)棕櫚誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、前言：
　　 Ghrelin是一種由28個(gè)氨基酸組成的多肽,主要來源于胃。以?；头酋；瘍煞N分子形式存在。Ghrelin是生長(zhǎng)激素的內(nèi)源性配體,能夠刺激生長(zhǎng)激素分泌和通過依賴生長(zhǎng)激素增加攝食和減少脂肪利用,從而導(dǎo)致能量正平衡。Ghrelin還發(fā)揮多種外周作用,包括胰腺的外分泌和內(nèi)分泌功能、糖代謝、心血管系統(tǒng)、胃的分泌作用和睡眠。Ghrelin通過抑制凋亡發(fā)揮對(duì)多種細(xì)胞的保護(hù)作用,如脂肪細(xì)胞、皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、心肌細(xì)胞

2、和內(nèi)皮細(xì)胞。Ghrelin被證實(shí)能夠與正常人和鼠的心血管組織結(jié)合,近期有許多關(guān)于ghrelin心血管作用的研究,但其細(xì)胞及分子機(jī)制不明確。有研究表明高心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的病理狀態(tài)下,如單純性肥胖、胰島素抵抗、高血壓病和2型糖尿病,其血漿ghrelin水平是的降低的。內(nèi)皮細(xì)胞受損是糖尿病相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)和心血管并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵事件。細(xì)胞凋亡的增加與內(nèi)皮受損及心血管疾病相關(guān)。游離脂肪酸參與導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功

3、能失調(diào)、動(dòng)脈粥樣硬化及炎癥反應(yīng)。棕櫚酸是體內(nèi)含量最多的游離脂肪酸,研究表明棕櫚酸能夠增加體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及增加活性氧的生成。有研究表明,Ghrelin能夠?qū)Χ喾N外來刺激下的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用,但是未見關(guān)于ghrelin對(duì)棕櫚酸環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用研究的報(bào)道。
　　 氧化應(yīng)激參與絕大多數(shù)心血管疾病,氧化應(yīng)激與抗氧化能力的失衡可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)。許多存活因子通過活化特殊的信號(hào)通路抑制凋亡信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。細(xì)

4、胞磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Pphosphatidylinositol-3-kinase/Akt)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活,已有研究表明該通路在ghrelin的保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用,然而該信號(hào)通路在ghrelin的保護(hù)效應(yīng)中的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制不明確?；谶@些觀察,我們?cè)O(shè)想ghrelin能夠保護(hù)棕櫚酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。該實(shí)驗(yàn)中我們研究了棕櫚酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響和對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。因?yàn)檠趸瘧?yīng)激在凋亡中發(fā)揮重要作用

5、,我們研究了ghrelin對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的活性氧生成的影響。因?yàn)锽cl-2通過與促凋亡的Bax蛋白結(jié)合起到抑制凋亡的作用,所以有理由相信Bcl-2與Bax的比率是決定細(xì)胞命運(yùn)的一個(gè)重要因素。最后,我們研究了ghrelin對(duì)于Bcl-2與Bax蛋白比率的影響。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 Wistar大鼠;胃饑餓素(Ghrelin),不含游離脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA),棕櫚酸(PA),hoech

6、st33258,MTT,PI3K/AKT阻斷劑LY294002,ERK1/2阻斷劑PD90859;實(shí)驗(yàn)使用的蛋白抗體有AKT及其第473位絲氨酸磷酸化一抗,Caspase3活性檢測(cè)試劑盒;AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的原代、傳代培養(yǎng)及鑒定雄性大鼠通過腹腔注射氨基甲酸乙酯麻醉,分離胸主動(dòng)脈并將其浸入PBS中,用鑷子迅速剝離脂肪或周圍組織?？v行剪開主動(dòng)

7、脈,于血管內(nèi)膜滴加0.1％Ⅰ型膠原酶,37℃消化30分鐘。用剪刀將血管剪成大致2mm見方的小塊,內(nèi)膜朝下貼于6孔板中,滴加少許DMEM,將6孔板于37℃溫箱中倒置約1小時(shí),然后加入培養(yǎng)基,每3天換液。組織塊周圍細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80-90％融合時(shí)用0.25％胰酶消化,離心后接種于6孔板,每2-3天換液。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90％融合時(shí)用0.25％胰酶消化傳代。組織塊或細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用DMEM培養(yǎng)基,其中添加20％胎牛血清、1％青-鏈霉素、0.15mg/

8、ml的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物,于37℃含5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3-5傳代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。通過其鋪路石樣形態(tài)及Ⅷ因子檢測(cè)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 2、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性細(xì)胞接種于96孔板中,每孔含100μl培養(yǎng)液,加入20μl of MTT工作液(5mg/ml),37℃避光孵育4h,加入150μl二甲基亞砜(DMSO)。于570 nm下測(cè)定吸光度。
　　 3、Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡將各組處理后的細(xì)胞用PBS洗

9、2次,4％多聚甲醛固定10min,加100μl Hoechst33258染色,室溫下放置10分鐘,PBS洗2次后于熒光顯微鏡下觀察。
　　 4、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將細(xì)胞洗滌、消化、重懸,行細(xì)胞計(jì)數(shù),每管細(xì)胞含1×106個(gè)細(xì)胞。重懸細(xì)胞后加入160μl annexin V-FITC細(xì)胞結(jié)合液,室溫避光孵育10min,收集細(xì)胞并重懸,加入190μl annexin V-FITC細(xì)胞結(jié)合液,加入碘化丙

10、啶染色液,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　 5、分光光度計(jì)檢測(cè)caspase-3活性細(xì)胞用PBS洗2次,2000rpm/min離心5min,去除PBS,沉淀細(xì)胞中加入50μl冰冷裂解液和0.5μl DTT,冰上裂解60min,4℃10000rpm/min離心1min,加50μl2×2×Reaction Buffer/DTTMix,加5μL caspase-3 substrate(Ac-DEVD-pNA),37℃4h。分光光度計(jì)在400nm

11、波長(zhǎng)測(cè)定其吸光值。
　　 6、細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)應(yīng)用DCFH-DA通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧,將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗二次,加入HBSS稀釋的DCFH-DA(2μmol/L)熒光探針37℃繼續(xù)孵育20min,培養(yǎng)結(jié)束后用冰PBS洗脫二次,收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
　　 7、Western blot分析磷酸化Akt、總Akt、Bax和Bcl-2用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取蛋白質(zhì),進(jìn)行10％SDS-PAGE,1×TB

12、S(pH7.6)洗3次,轉(zhuǎn)膜后5％脫脂奶粉封閉2h,加一抗4℃孵育過夜,加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗雜交2h,洗膜后ECL超敏發(fā)光液進(jìn)行顯色,結(jié)果用Scion Image分析軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。
　　 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次或3次以上,分析方法采用單因素方差分析,組間差異比較采用Dunnett's檢驗(yàn),P＜0.05差異有顯著性。
　　

13、 結(jié)果：
　　 1、大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈鋪路石樣生長(zhǎng),Ⅷ因子染色陽性。
　　 2、MTT檢測(cè)結(jié)果顯示ghrelin孵育細(xì)胞24h在加入或不加棕櫚酸情況下均增加細(xì)胞活性(P＜0.05)。
　　 3、Hoechst33258和Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示,棕櫚酸孵育細(xì)胞24h增加細(xì)胞凋亡(P＜0.01),Ghrelin與棕櫚酸共同孵育細(xì)胞較棕櫚酸單獨(dú)作用下細(xì)胞凋亡減少(P＜0.01)。0.3mM棕

14、櫚酸孵育細(xì)胞24h顯著增加caspase-3活性(P＜0.01),Ghrelin與棕櫚酸共同孵育細(xì)胞較棕櫚酸單獨(dú)作用下caspase-3降低(P＜0.05)。
　　 4、Ghrelin(100nM)迅速增加Akt磷酸化,30min達(dá)高峰,至少持續(xù)60min。Ghrelin呈劑量依賴性活化Akt。PI3K抑制劑,LY294002抑制ghrelin誘導(dǎo)的Akt磷酸化(P＜0.01)。Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示,L

15、Y294002降低了ghrelin抑制棕櫚酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用(P＜0.01)。
　　 5、0.3 mM棕櫚酸孵育細(xì)胞24h較對(duì)照組增加ROS生成(P＜0.01),棕櫚酸與ghrelin共同作用下ROS的生成較棕櫚酸單獨(dú)作用下減少(P＜0.05)。
　　 6、0.3 mM棕櫚酸孵育細(xì)胞24h降低了Bcl-2/Bax比率(P＜0.01),ghrelin與棕櫚酸共同作用下較棕櫚酸單獨(dú)作用下增加了Bcl-2/Bax比率(P＜0

16、.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、0.3mM棕櫚酸作用下增加細(xì)胞凋亡。
　　 2、Ghrelin抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　 3、Ghrelin通過降低棕櫚酸誘導(dǎo)的ROS生成增加起到細(xì)胞保護(hù)作用。
　　 4、Ghrelin誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞Akt磷酸化,PI3K阻斷劑LY294002降低了ghrelin對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用,提示ghrelin對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用至少是部分通過