游離脂肪酸及葡萄糖對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響及作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 為研究脂毒性對(duì)大血管的損傷作用，我們利用游離脂肪酸(Free Fatty Acids，F(xiàn)FAs)干預(yù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Rat Aorta Endothelial Cell，RAEC)，探討游離脂肪酸對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響及作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(RACE)，采用不同濃度的葡萄糖(5.5mmol/L,30mmol/L)及棕櫚酸(200μmol/L、4

2、00μmol/L、600μmol/l。)單獨(dú)或聯(lián)合作用于培養(yǎng)成功的RAEC24h、48h、72h，設(shè)立正常對(duì)照組和d-BSA對(duì)照組。①倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察；②采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞增長(zhǎng)曲線：③免疫組織化學(xué)染色方法鑒定內(nèi)皮細(xì)胞；④應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)不同環(huán)境下FFAs對(duì)RAEC增殖的影響；⑤免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)處理前后RAEC中白細(xì)胞介素-8(IL-8)，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma2，bcl-2)，Bcl

3、-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Assaciated X protein,bax)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 ①RAEC形態(tài)學(xué)觀察原代細(xì)胞在培養(yǎng)5-7天后，在主動(dòng)脈貼壁附近可見少量游出的內(nèi)皮細(xì)胞；培養(yǎng)到12-13天，可見遷移出的細(xì)胞呈片生長(zhǎng)，70％-80%單層融合，分布密度不均。培養(yǎng)出的內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形、多角形，邊界清晰，胞漿豐富，核清晰，鋪滿后，細(xì)胞排列緊密，可見典型的“鋪路石”狀排列的單層細(xì)胞，并有接觸抑制現(xiàn)象。培養(yǎng)至

4、7-8代后，細(xì)胞變瘦小，分泌物增多，可見細(xì)胞分化，成老化狀態(tài)。
　　 ②細(xì)胞生長(zhǎng)曲線大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在傳代接種2h后開始貼壁，24h后90%細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，24h-48h間細(xì)胞量有所減少,48h后可見新長(zhǎng)出的細(xì)胞為單層、互不重疊，傳代細(xì)胞增殖速率較原代細(xì)胞增長(zhǎng)稍快，第4-7天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第8-9天為平臺(tái)期。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型。
　　 ③內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈典型的“鋪路石”狀單層排列貼壁生長(zhǎng)，CD31

5、相關(guān)抗原鑒定示：細(xì)胞呈圓形、梭形或多邊形，細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒，而對(duì)照組內(nèi)未見著色，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 ④MTT檢測(cè)RAEC增殖不同劑量的棕櫚酸、葡萄糖及聯(lián)合培養(yǎng)組處理內(nèi)皮細(xì)胞24h、48h、72h后，與正常培養(yǎng)液組及d-BSA對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中24h低劑量PA組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；相同濃度時(shí)，24h與72h組內(nèi)比較，高糖組、高、中、低劑量棕櫚

6、酸組差異顯著(P＜0.01)，聯(lián)合培養(yǎng)組不同時(shí)間段差異均顯著(P＜0.01)；高糖組、中、高劑量棕櫚酸組48h與72h組內(nèi)比較，24h與48h組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，低劑量組24h與48h,48h與72h組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。正常培養(yǎng)液組與d-BSA組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 ⑤免疫組化法檢測(cè)結(jié)果正常對(duì)照組、d-BSA對(duì)照組培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞48h后，IL-8、BAX幾乎不表達(dá)或弱

7、表達(dá)，兩對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。不同濃度FFAs、高糖及聯(lián)合培養(yǎng)組處理細(xì)胞后，細(xì)胞IL-8表達(dá)明顯增高，且具有劑量依賴關(guān)系，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；細(xì)胞bcl-2表達(dá)隨濃度的增高表達(dá)逐漸減弱，與正常對(duì)照組及d-BSA對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而細(xì)胞BAX表達(dá)則隨濃度的增加表達(dá)亦增強(qiáng)，與正常對(duì)照組及d-BSA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Bcl-2/bax比值隨葡

8、萄糖及棕櫚酸濃度增高逐漸減低，聯(lián)合培養(yǎng)組為甚。
　　 結(jié)論：
　　 體外培養(yǎng)并獲得7代內(nèi)皮細(xì)胞，形態(tài)學(xué)觀察及CD31相關(guān)抗原鑒定證實(shí)本實(shí)驗(yàn)成功的培養(yǎng)原代及傳代生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞；本培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)便，周期較短，價(jià)格低廉，內(nèi)皮細(xì)胞純度較高，適宜實(shí)驗(yàn)所需。高濃度FFAs及高糖具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡的作用，并且具有時(shí)間濃度依賴性。這種作用機(jī)制可能是通過葡萄糖及棕櫚酸酯參與P13K/AKT等途徑激活氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)