雙環(huán)鉑對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、藥物洗脫支架(DES)是介入心臟病學(xué)的重要進(jìn)展，DES使支架內(nèi)再狹窄率由裸金屬支架時(shí)代的20-30％下降到10％左右，然而DES輕度但有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義地增加了極晚期血栓形成的發(fā)生率。其原因可能與不能降解的多聚物涂層引起的炎癥或過(guò)敏反應(yīng)有關(guān);也可能與DES攜載的抗細(xì)胞增殖藥物有關(guān)，這些藥物有效地抑制了支架置入術(shù)后血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增生，但同時(shí)也抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞再生，延遲內(nèi)皮愈合，從而增加支架內(nèi)血栓的風(fēng)險(xiǎn)。人們期待研發(fā)出既能有效抑制平滑肌細(xì)胞

2、增生，又對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞再生無(wú)明顯影響的藥物作為DES攜載的藥物。
　　 雙環(huán)鉑是繼卡鉑、順鉑后應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療的第三代鉑類(lèi)制劑，由北京興大科學(xué)系統(tǒng)公司開(kāi)發(fā)，是我國(guó)具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的化學(xué)Ⅰ類(lèi)抗癌新藥，雙環(huán)鉑的研究目前尚處于實(shí)驗(yàn)室研究和Ⅲ期臨床研究階段，現(xiàn)有資料表明，其抗癌療效好，毒性低。我們擬研究其對(duì)平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞增生的影響，探討作為支架攜載藥物的可能性。目前尚無(wú)雙環(huán)鉑對(duì)正?；蛄夹栽錾慕M織、細(xì)胞影響研究的文獻(xiàn)報(bào)道。

3、r>　　 目的：
　　 本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)入主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)，MTS法檢測(cè)不同濃度的雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC增殖的影響，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC細(xì)胞周期的影響，探討其可能的作用機(jī)制，旨在評(píng)價(jià)新藥雙環(huán)鉑在防治支架置入術(shù)后再狹窄方面的潛在價(jià)值。在分子水平上，通過(guò)檢測(cè)雙環(huán)鉑干預(yù)后HASMC和HAEC細(xì)胞增殖核抗原PCNA，促凋亡蛋白Bax，抗凋亡蛋白

4、Bcl-2，探討雙環(huán)鉑在增殖和凋亡方面對(duì)HASMC和HAEC的影響。
　　 方法：
　　 一、MTS法檢測(cè)雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC增殖的影響
　　 通過(guò)體外擴(kuò)增、培養(yǎng)HASMC和HAEC細(xì)胞株。10μg/ml，1μg/ml，100ng/ml雙環(huán)鉑干預(yù)培養(yǎng)HASMC，10μg/ml，1μg/ml雙環(huán)鉑干預(yù)培養(yǎng)HAEC，藥物干預(yù)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，探討雙環(huán)鉑

5、的對(duì)HASMC和HAEC抑制增殖作用與時(shí)間、濃度的關(guān)系。
　　 雙環(huán)鉑100μg/ml起倍比稀釋到0.39μg/ml共9個(gè)濃度組，干預(yù)培養(yǎng)HASMC72小時(shí)，雙環(huán)鉑200μg/ml起倍比稀釋到1.56μg/ml共8個(gè)濃度組，干預(yù)培養(yǎng)HAEC72小時(shí)，MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，以log（雙環(huán)鉑濃度）與細(xì)胞生長(zhǎng)率為變量作圖，得出雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC的半數(shù)抑制率IC50。
　　 雙環(huán)鉑濃度分別為10μg/ml，1μg/

6、ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，干預(yù)培養(yǎng)HASMC和HAEC72小時(shí)，使用雷帕霉素作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。使用SPSS10.0軟件，單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探求雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC抑制增殖的最小有效濃度。
　　 二、流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC細(xì)胞周期的影響
　　 HASMC和HAEC接種24小時(shí)后，無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞周期同步化，HASMC分為

7、6組，分別為正常對(duì)照組，雷帕霉素1ng/ml陽(yáng)性對(duì)照組，雙環(huán)鉑1μg/ml組，100ng/ml組，10ng/ml組，1ng/ml組。HAEC分為6組，分別為正常對(duì)照組，雷帕霉素10ng/ml組，雙環(huán)鉑10μg/ml組，1μg/ml組，100ng/ml組，10ng/ml組。藥物干預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞，低溫固定，碘化丙啶(PI)單染，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。
　　 三、免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)雙環(huán)鉑對(duì)

8、細(xì)胞增殖蛋白PCNA和凋亡蛋白Bax，Bcl-2表達(dá)的影響
　　 HASMC和HAEC接種培養(yǎng)24小時(shí)后，改用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，HASMC分為6組，分別加入雙環(huán)鉑1μg/ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，陽(yáng)性對(duì)照組加入1ng/ml雷帕霉素，正常對(duì)照組予含2％血清的SMCM培養(yǎng)。HAEC分為6組，分別加入雙環(huán)鉑10μg/ml，1μg/ml，100ng/ml，10ng/ml，陽(yáng)性對(duì)照組加入10ng/ml雷

9、帕霉素，正常對(duì)照組予含有5％血清的ECM培養(yǎng)。藥物干預(yù)48小時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白。Western Blot法分別檢測(cè)HASMC和HAEC的細(xì)胞增殖核抗原PCNA，促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 一、雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC增殖的影響
　　 對(duì)于HASMC，雙環(huán)鉑10μg/ml組干預(yù)1天，2天，3天的增殖抑制率分別為16％，39％，75％，1μg/ml組增殖抑制率分別為13

10、％，13％，27％，100ng/ml組增殖抑制率分別為11％，9％，20％。對(duì)于HAEC，雙環(huán)鉑10μg/ml干預(yù)1天，2天，3天的增殖抑制率分別為6.41％，11.05％，14.83％，1μg/ml組干預(yù)HAEC增殖抑制率分別為1.35％，0.60％，1.3％。
　　 雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為3.47μg/ml，72.44μg/ml，兩者相差20.88倍。
　　 雙環(huán)鉑濃度分別為10

11、μg/ml，1μg/ml，100ng/ml，10ng/m1，1ng/ml時(shí)，干預(yù)培養(yǎng)HASMC和HAEC3天，10ng/m1以上濃度HASMC增殖受到明顯抑制(P＜0.05)，1ng/ml時(shí)雙環(huán)鉑對(duì)HASMC無(wú)明顯增殖抑制(P=0.83);在10μg/ml以上濃度時(shí)HAEC增殖受到明顯抑制(P＜0.001)，雙環(huán)鉑濃度在1ng/ml-1μg/ml時(shí)，對(duì)HAEC無(wú)明顯增殖抑制作用(P＞0.05)，雙環(huán)鉑對(duì)HAEC的最小有效抑制濃度較對(duì)HA

12、SMC的最小有效抑制濃度高1000倍。陽(yáng)性對(duì)照藥物雷帕霉素在1ng/ml時(shí)，即表現(xiàn)出對(duì)HASMC和HAEC的抑制增殖作用，相同濃度下，對(duì)HAEC抑制作用稍弱。
　　 二、雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC細(xì)胞周期的影響
　　 雙環(huán)鉑干預(yù)HASMC生長(zhǎng)48小時(shí)后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，試驗(yàn)重復(fù)4次，1μg/ml雙環(huán)鉑對(duì)HASMC作用48小時(shí)，G2/M期細(xì)胞百分比增加，細(xì)胞周期阻滯在GE/M期，10ng/ml-100ng/ml雙

13、環(huán)鉑對(duì)HASMC作用48小時(shí)，S期細(xì)胞百分比增加，細(xì)胞周期阻滯于S期。陽(yáng)性對(duì)照藥物雷帕霉素對(duì)細(xì)胞周期的阻滯在G0/G1期。
　　 雙環(huán)鉑干預(yù)HAEC生長(zhǎng)48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，在10μg/ml以上濃度時(shí)HAEC S期數(shù)目明顯增加，雙環(huán)鉑對(duì)HAEC周期的阻滯處于S期。在10μg/ml以下濃度時(shí)雙環(huán)鉑對(duì)細(xì)胞周期的阻滯不顯著。陽(yáng)性對(duì)照藥物雷帕霉素組，G0/G1期細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。
　　 在

14、對(duì)HASMC和HAEC細(xì)胞周期檢測(cè)中各藥物組及正常對(duì)照組均未見(jiàn)凋亡峰(Sub-G1)。
　　 三、雙環(huán)鉑干預(yù)培養(yǎng)后HASMC和HAEC細(xì)胞增殖蛋白PCNA和凋亡蛋白Bax，Bcl-2表達(dá)的變化
　　 HASMC在不同濃度雙環(huán)鉑干預(yù)下，PCNA蛋白的表達(dá)量明顯下降，其中雙環(huán)鉑100ng/mL組PCNA表達(dá)量達(dá)最低值。HAEC在不同濃度雙環(huán)鉑干預(yù)下，10μg/ml組和100ng/ml組PCNA表達(dá)量輕度減低，其他濃度組PCN

15、A表達(dá)無(wú)明顯變化。雷帕霉素在HASMC和HAEC中均抑制了PCNA的表達(dá)。
　　 在HASMC中，促凋亡蛋白Bax在各雙環(huán)鉑濃度組表達(dá)量均明顯上升?？沟蛲龅鞍譈cl-2表達(dá)在雙環(huán)鉑1μg/ml組升高，在100ng/ml組較正常組相比無(wú)明顯差異，在10ng/ml、1ng/ml組Bcl-2表達(dá)稍減低，Bax/Bcl-2比值增高，即雙環(huán)鉑有促進(jìn)凋亡作用。雷帕霉素組Bax/Bcl-2較正常對(duì)照組無(wú)明顯變化。在HAEC中，Bax在各雙環(huán)鉑

16、濃度組表達(dá)均升高，且隨著藥物濃度上升，Bax表達(dá)量有升高趨勢(shì)。雷帕霉素組Bax表達(dá)較正常組降低。在同樣的試驗(yàn)條件下，未檢測(cè)到HAEC中Bcl-2蛋白表達(dá)。上述結(jié)果表明雙環(huán)鉑對(duì)HAEC也有促進(jìn)凋亡的作用，低濃度的雷帕霉素?zé)o促凋亡作用。
　　 結(jié)論：
　　 雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC產(chǎn)生抑制增殖作用與藥物作用時(shí)間、濃度呈正相關(guān)。隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物濃度的增加，雙環(huán)鉑對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸加強(qiáng)。
　　 雙環(huán)

17、鉑對(duì)HASMC的半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.47μg/ml，對(duì)HAEC的半數(shù)抑制濃度為72.44μg/ml，兩者相差20.88倍。雙環(huán)鉑對(duì)HAEC抑制增殖的最低有效濃度（10μg/ml）較對(duì)HASMC抑制增殖的最低有效濃度(10ng/ml)高1000倍。
　　 雙環(huán)鉑對(duì)HASMC和HAEC細(xì)胞周期的影響檢測(cè)表明，雙環(huán)鉑為非特異性細(xì)胞周期阻滯藥物。
　　 雙環(huán)鉑干預(yù)HASMC和HAEC后，HASMC表達(dá)PCNA顯著下降，

18、而HAEC表達(dá)PCNA正?；蜉p度下降，結(jié)果表明相同濃度下雙環(huán)鉑對(duì)HASMC的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)HAEC的增殖抑制作用。雙環(huán)鉑干預(yù)HASMC和HAEC后，促進(jìn)HASMC凋亡蛋白的表達(dá)，表明雙環(huán)鉑在細(xì)胞凋亡的線粒體通路上，通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)，產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。但是這種促進(jìn)凋亡的作用只體現(xiàn)在蛋白水平上，在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞檢測(cè)未見(jiàn)凋亡峰出現(xiàn)。
　　 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，盡管在蛋白檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)升高