EGCG對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　冠心病的介入治療（PCI）是缺血性心臟病治療學(xué)上的一次革命，但術(shù)后支架內(nèi)再狹窄（ISR）的發(fā)生仍是臨床面對(duì)的挑戰(zhàn)。平滑肌細(xì)胞是再狹窄的中心環(huán)節(jié),再狹窄形成是血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的形成和降解等動(dòng)態(tài)變化的過程。VSMC向內(nèi)膜下遷移并增殖過度是血管增殖性疾病的主要發(fā)病機(jī)制，抑制VSMC增殖，有望成為治療和預(yù)防血管增殖性疾病新的方法。
　　表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶中提取的一

2、種主要的茶多酚，具有廣泛的生物活性，以其抗腫瘤，保護(hù)心血管，調(diào)節(jié)血脂，抗氧化等方面的作用倍受人們關(guān)注。EGCG具有抑制VSMC增殖、抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制血小板聚集等作用，能夠針對(duì)多種再狹窄機(jī)制而發(fā)揮抗再狹窄作用。研究顯示EGCG對(duì)心血管疾?。–VD）有預(yù)防和治療作用,與動(dòng)脈粥樣硬化（AS）引起的冠心病、心肌梗死和中風(fēng)導(dǎo)致的死亡呈負(fù)相關(guān)，EGCG具有抑制大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷后再狹窄的作用。還有研究還發(fā)現(xiàn)，EGCG在細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)血

3、小板源性生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和高糖誘導(dǎo)的VSMC增殖、遷移具有抑制作用。認(rèn)為EGCG可通過PKC和ERK1/2、MAPK途徑抑制VSMC增殖。
　　線粒體融合蛋白-2（Mfn-2）是由我國(guó)學(xué)者通過差異顯示技術(shù)分離得到的一個(gè)新基因，研究發(fā)現(xiàn)此基因與細(xì)胞增殖、凋亡及線粒體融合密切相關(guān)，故先后改稱為增殖抑制基因（HSG）及 Mfn-2。因其具有抑制 VSMC增殖功能，血管增殖性疾病和腫瘤中的

4、Mfn-2表達(dá)下調(diào)，有望成為血管增殖性疾病新的干預(yù)靶點(diǎn)，最近的研究也越來(lái)越關(guān)注 Mfn-2的作用。Mfn-2的表達(dá)與血壓具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，在高增殖性動(dòng)脈疾病中，rMfn-2基因的表達(dá)明顯下降，腺病毒基因傳遞的rMfn-2能有效防止大鼠頸動(dòng)脈球囊成形術(shù)后誘導(dǎo)的再狹窄。有關(guān)Mfn-2抑制VSMC增殖的機(jī)制研究，目前主要集中在Mfn-2下游信號(hào)調(diào)控方面，認(rèn)為Mfn-2通過Ras-Raf-ERK/MAPK和Ras-PI3K-Akt兩條信號(hào)途徑抑制

5、VSMC增殖，促進(jìn)其凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL能誘導(dǎo)VSMC增殖，過表達(dá)Mfn-2通過下調(diào)ERK和Akt磷酸化而拮抗此作用。還有研究發(fā)現(xiàn)β受體-cAMP信號(hào)通路可通過上調(diào)Mfn-2的表達(dá)抑制 VSMC增殖，纈沙坦對(duì)AngII誘導(dǎo)的VSMC增殖的抑制作用與上調(diào) Mfn-2和抑制Ras-Raf-MEK-ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。
　　EGCG可抑制內(nèi)膜損傷后的動(dòng)脈再狹窄，而 Mfn-2亦能有效防止大鼠頸動(dòng)脈球囊成形術(shù)后誘導(dǎo)的再狹窄，

6、提示EGCG、Mfn-2之間可能存在聯(lián)系，EGCG是否通過Mfn-2來(lái)抑制VSMC增殖？機(jī)制方面，EGCG可通過ERK/MAPK途徑抑制VSMC增殖，Mfn-2也可通過Ras-Raf-ERK/MAPK和Ras-PI3K-Akt兩條信號(hào)途徑抑制VSMC增殖，促進(jìn)其凋亡。提示EGCG、Mfn-2和ERK/MAPK之間可能存在聯(lián)系，EGCG是否通過上調(diào)Mfn-2的表達(dá)抑制Ras-Raf-ERK/MAPK信號(hào)通路的活性從而發(fā)揮抑制VSMC增殖的

7、作用?目前國(guó)內(nèi)外尚未有EGCG對(duì)血管平滑肌細(xì)胞Mfn-2表達(dá)影響以及它們?nèi)咧g關(guān)系的研究。
　　目的：
　　研究EGCG對(duì)VSMC增殖及Mfn-2、p-c-Raf、p-ERK1/2表達(dá)的影響，以及在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HASMC）增殖中EGCG、Mfn-2、ERK/MAPK三者之間的關(guān)系，探討EGCG是否是通過上調(diào)Mfn-2來(lái)發(fā)揮抗增殖作用及其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)HASMCs，第4~6代細(xì)胞用

8、于實(shí)驗(yàn)。siRNA沉默Mfn-2，siMfn-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別給予不同濃度EGCG（1，5，25，50，100μmol/L），不同時(shí)間（0 h，6 h，12 h，18 h，24 h，48 h）處理，siRNA干擾處理隨機(jī)分為六組：對(duì)照（C），空白對(duì)照siRNA（NC）， Mfn-2干擾組（siMfn-2），EGCG組（50μmol/L），NC+EGCG組，和siMfn-2+EGCG組。用 EdU法觀察不同處理方法對(duì)HASMC增殖的影響。

9、分別用 Q-PCR，Western blot方法檢測(cè)Mfn-2、p-c-Raf、p-ERK1/2的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.5-100μmol/L的EGCG在6–48 h內(nèi)均能明顯抑制HASMC增殖。
　　2. siRNA能有效沉默Mfn-2基因表達(dá)（P<0.01），轉(zhuǎn)染效率為72.7％。siRNA沉默Mfn-2后，EGCG介導(dǎo)的抑制細(xì)胞增殖的作用明顯減弱（P<0.01）。
　　3. EGCG上調(diào) Mfn-

10、2的表達(dá)（P<0.01）。
　　4. EGCG下調(diào)p-c-Raf和p-ERK1/2的表達(dá)（P<0.01）。
　　5. siRNA沉默Mfn-2可拮抗EGCG介導(dǎo)的Mfn-2上調(diào)作用（P<0.01）。
　　6. siRNA沉默Mfn-2可拮抗EGCG介導(dǎo)的p-c-Raf、p-ERK1/2的下調(diào)作用（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　EGCG在抑制HASMC增殖的同時(shí)顯著上調(diào)Mfn-2的表達(dá)，siRNA沉默Mf