高糖通過環(huán)氧化酶2依賴性途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激.pdf

1、背景： 心血管并發(fā)癥被認(rèn)為是糖尿病患者的主要死亡原因之一。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)，血糖增高引起的血管內(nèi)皮代謝紊亂和形態(tài)異常是糖尿病血管損傷的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高糖可以誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，但是其作用機(jī)制尚不明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)途徑是近年來發(fā)現(xiàn)的一條細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的破壞能夠影響蛋白質(zhì)的折疊，從而引起非折疊蛋白應(yīng)答(unfolded protein response，UP

2、R)或稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)?；瘜W(xué)毒素，氧化應(yīng)激與／或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白的積累都會破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。高糖誘導(dǎo)的線粒體活性氧釋放增加是導(dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的主要因素。所以，我們推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑亦可能參與了高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過程。 近年來，血糖增高誘發(fā)的炎癥被認(rèn)為是糖尿病心血管病變的另一主要機(jī)制。有證據(jù)均提示，內(nèi)皮源性的

3、COX-2可能是糖尿病介導(dǎo)血管炎性反應(yīng)的重要遞質(zhì)，但COX-2是否亦參與了高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑還有待于進(jìn)一步證明。 目的： 本實(shí)驗(yàn)將主要觀察高糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑中標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和C／EBP同源蛋白(C／EBP homologous protein，CHOP)的影響，并闡明COX-2在其中的作用。 方法

4、： (1)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)分別用含5.5mmol／L與30mmol／L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行處理24、36和48 h。(2)細(xì)胞活性用MTT法米測定。(3)細(xì)胞凋亡用PI染色流式細(xì)胞術(shù)來確定。(4)COX-2，GRP78和CHOP的表達(dá)情況用Western Blotting來確定。 結(jié)果： 高糖對HUVECs細(xì)胞存活

5、率的影響分別用含正常糖(5.5mmol／L)和高糖(30mmol／L)的DMEM培養(yǎng)基孵育HUVECs細(xì)胞24，36或48 h后，用M訂法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，高糖孵育24 h對細(xì)胞存活率無明顯影響。然而，高糖孵育36～48 h后，高糖組的OD值明顯低于相應(yīng)對照組(P＜0.01)與相應(yīng)對照組相比，甘露醇處理對細(xì)胞存活率無明顯影響。 高糖對HUVECs細(xì)胞GRP78和CHOP蛋白表達(dá)的影響Western Blotting結(jié)果顯

6、示，與相同孵育時(shí)間的正常糖對照組相比，HUVECs細(xì)胞經(jīng)高糖孵育24～36 h后，GRP78蛋白表達(dá)量增高(P＜0.01)；但細(xì)胞經(jīng)高糖孵育48 h后，GRP78蛋白表達(dá)量反而減少(P＜0.05)。HUVECs細(xì)胞經(jīng)高糖孵育24h后，對CHOP蛋白的表達(dá)量無明顯影響，但對細(xì)胞經(jīng)高糖孵育36～48 h后，CHOP蛋白的表達(dá)量明顯增加(P＜0.01)。甘露醇對GRP78和CHOP蛋白表達(dá)量均無明顯影響。 高糖對HUVECs細(xì)胞COX

7、-2蛋白表達(dá)的影響Western Blotting結(jié)果顯示，與相同孵育時(shí)間的正常糖對照組相比，HUVECs細(xì)胞經(jīng)高糖孵育24-48 h后，COX-2蛋白表達(dá)量逐漸增高(P＜0.01)，并呈現(xiàn)時(shí)間依從性。甘露醇對HUVECs細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)量無明顯影響。 COX-2抑制劑尼美舒利對GRP-78和CHOP蛋白表達(dá)的影響Western Blotting結(jié)果顯示，與正常糖組對照相比，HUVECs細(xì)胞經(jīng)高糖孵育48 h后，GRP78

8、蛋白表達(dá)減少而CHOP蛋白表達(dá)增加：然而，經(jīng)尼美舒利與高糖共孵育后，可明顯抑制高糖引起的GRP78蛋白表達(dá)減少，以及CHOP蛋白表達(dá)增加P＜0.05)。單純尼美舒利對HUVECs細(xì)胞GRP78和CHOP蛋白表達(dá)均明顯影響。 尼美舒利對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞生存率下降和細(xì)胞凋亡的影響與正常糖對照組相比，用含高糖的DMEM培養(yǎng)基孵育HUVECs細(xì)胞48 h后，細(xì)胞生存率下降，細(xì)胞凋亡增加。尼美舒利對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞生存率下降和細(xì)胞凋亡有顯著抑