微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)造血干細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的：研究微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MEC）對(duì)造血干細(xì)胞（HSC）增殖的影響，尋找促進(jìn)HSC增殖的方法。
　　方法：
　　1. MEC分離、培養(yǎng)及鑒定：將肺組織經(jīng)I型膠原酶消化獲得的細(xì)胞，在20％FBS、2ng/mlVEGF、肝素100u/ml、DMEM-F12中培養(yǎng)，24h全換液，此后每2-3天全量換液，鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況，取第8天細(xì)胞進(jìn)行FITC-CD31免疫熒光鑒定，“鋪路石”細(xì)胞用于流式鑒定、傳代培養(yǎng)和共培養(yǎng)。連續(xù)

2、8天觀(guān)察P1代MEC生長(zhǎng)情況、形態(tài)變化，并逐日細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制P1代MEC生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
　　2.GFP小鼠HSC的分離、鑒定：密度梯度離心法獲得小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，MACS-CD117+磁珠分選HSC。應(yīng)用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（FACS）檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的純度及HSC CD117CD34共表達(dá)率。
　　3.微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)造血干細(xì)胞增殖的研究：設(shè)立對(duì)照組（HSC）、共培養(yǎng)組（MEC+HSC），體外培養(yǎng)7天，觀(guān)察HSC生長(zhǎng)情況、細(xì)

3、胞計(jì)數(shù)、繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)、計(jì)算HSC擴(kuò)增倍數(shù)。收集共培養(yǎng)組HSC，F(xiàn)ACS檢測(cè)共培養(yǎng)組HSC CD117CD34共表達(dá)率，與共培養(yǎng)前對(duì)比。
　　結(jié)果：
　　1.MEC分離、培養(yǎng)及鑒定：原代細(xì)胞：6h貼壁，24h少數(shù)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞呈圓形。48h見(jiàn)多角形、短梭形細(xì)胞。第3d細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，形成形態(tài)大小較一致的細(xì)胞團(tuán)。第6d相鄰細(xì)胞偽足彼此相連，第10d細(xì)胞繼續(xù)增多，第14d細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合，呈“鋪路石”外觀(guān)。?傳代細(xì)胞：

4、4h貼壁，P1代MEC第3d見(jiàn)多角形、短梭形細(xì)胞。第4d細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，形成形態(tài)大小較一致的細(xì)胞團(tuán)，第7d細(xì)胞密集生長(zhǎng)，多數(shù)呈梭形、不規(guī)則形。第8d細(xì)胞生長(zhǎng)近80%融合。P1代MEC生長(zhǎng)曲線(xiàn)：第4到7天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨后進(jìn)入平臺(tái)期。CD31抗體免疫熒光檢測(cè)陽(yáng)性率為54.5%。MEC FACS鑒定vWF、CD31、CD34、CD45表達(dá)率分別為：81.39%、45.8%、57.48%、0.17%。
　　2.GFP小鼠HSC的分離、鑒定

5、：本實(shí)驗(yàn)中平均每只GFP小鼠骨髓經(jīng)密度梯度離心后可以獲得約1.1×108個(gè)MNC，活細(xì)胞率為98%。MNC經(jīng)MACS CD117磁珠分選后可以獲得約4.7×105個(gè) CD117+細(xì)胞，活率為97%。骨髓MNC中CD117+細(xì)胞含量約0.43%。磁珠分選后的CD117+HSC純度為99.51%，HSC CD117CD34共表達(dá)率為75.28%。熒光顯微鏡下：HSC呈綠色，圓形，大小均一。
　　3.微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)造血干細(xì)胞增殖的研究

6、：培養(yǎng)時(shí)間增加，兩組HSC數(shù)均增加，共培養(yǎng)組較對(duì)照組更明顯。共培養(yǎng)組與對(duì)照組細(xì)胞數(shù)的比值：第1d，共培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)約為對(duì)照組的1.21倍（P<0.01），第2d，共培養(yǎng)組約為對(duì)照組的1.35倍（P<0.05），第3d，共培養(yǎng)組約為對(duì)照組的1.50倍（P<0.01），第4d，共培養(yǎng)組約為對(duì)照組的1.72倍（P<0.01），第5d，共培養(yǎng)組約為對(duì)照組的1.71倍（P<0.01），第6d，共培養(yǎng)組約為對(duì)照組的1.75倍（P<0.01），第7d，

7、共培養(yǎng)組約為對(duì)照組的1.78倍（P<0.01）。共培養(yǎng)組與對(duì)照組細(xì)胞數(shù)比值變化曲線(xiàn)示：比值逐漸增加，第4d變化最明顯。D1-D7較D0的HSC數(shù)比較：第7d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴(kuò)增約12.31倍（P<0.01），對(duì)照組擴(kuò)增約6.92倍（P<0.01）；第6d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴(kuò)增約11.28倍（P<0.01），對(duì)照組擴(kuò)增約6.45倍（P<0.01）；第5d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴(kuò)增約9.72倍（P<0.01），對(duì)照組擴(kuò)增約5.66

8、倍（P<0.01）；第4d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴(kuò)增約7.31倍（P<0.01），對(duì)照組擴(kuò)增約4.25倍（P<0.01）；第3d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴(kuò)增約3.45倍（P<0.01），對(duì)照組擴(kuò)增約2.30倍（P<0.01）；第2d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴(kuò)增約1.92倍（P<0.01），對(duì)照組擴(kuò)增約1.42倍（P<0.01）；第1d與第0d相比，共培養(yǎng)組擴(kuò)增約1.20倍（P<0.01），對(duì)照組擴(kuò)增約0.99倍（P>0.05）。共培養(yǎng)7天后