膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用及機(jī)制的研究.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤是目前嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤。盡管近年來(lái)采用手術(shù)加放療、化療的綜合治療的方案,使膠質(zhì)瘤患者的生存率有所提高,但大多數(shù)患者的預(yù)后仍然不理想,仍存在術(shù)后復(fù)發(fā)、對(duì)放療不敏感及化療藥物耐受等問(wèn)題。近年腫瘤干細(xì)胞及其微環(huán)境理論認(rèn)為上述這些問(wèn)題與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(gliomastemcell,GSC)密切相關(guān),而GSC所處的微環(huán)境在其中起重要的調(diào)節(jié)作用。
　　為此本文采用體外transwell雙室共培養(yǎng)、PCR、West

2、ern-blot、RNAi基因干擾、ELISA檢測(cè)、細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)及與內(nèi)皮細(xì)胞共同移植的小鼠皮下膠質(zhì)瘤移植瘤模型等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法分三個(gè)部分探討了GSC與內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用及可能機(jī)制:第一部分是從腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞的角度出發(fā)探討內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)GSC干性特征(主要是自我更新能力)的影響及HH通路在其中所起的作用;第二部分是從內(nèi)皮細(xì)胞的角度出發(fā),探討GSC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移能力的影響及HH通路在其中所起的作用;第三部分是探索GSC與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用

3、時(shí)HH通路激活的可能因素,得到如下主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論:
　　主要結(jié)果:
　　1.內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)GSC自我更新和膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性特征的表達(dá)。
　　1.1極限稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后的GSC形成干細(xì)胞球數(shù)目明顯增多,體積明顯增大,尤其在每孔5個(gè)(24.3％vs11.3%)和每孔10個(gè)細(xì)胞(39.4%vs25.8%)的極低濃度下更加明顯。與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后的GL261細(xì)胞形成干細(xì)胞球體積也明顯增加。

4、r>　　1.2小鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)證明與內(nèi)皮細(xì)胞共注射的GSC成瘤能力更強(qiáng),瘤體體積顯著大于對(duì)照組(0.87±0.25cm3VS0.23±0.046cm3)。與內(nèi)皮細(xì)胞共注射的GL261細(xì)胞成瘤能力也比對(duì)照組顯著增強(qiáng)(0.093±0.068cm3VS0.039±0.043cm3)。
　　1.3PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后GSC的干性基因Olig2和Bmi1表達(dá)分別上調(diào)4.5倍和2.7倍,Western-blo

5、t實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述基因在蛋白水平表達(dá)也有明顯上調(diào)。
　　2.Hedgehog信號(hào)通路是介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞上述作用的重要通路。
　　2.1PCR與Western-blo實(shí)驗(yàn)證實(shí),與對(duì)照組相比,與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后GSC及GL261細(xì)胞內(nèi)的HH信號(hào)通路明顯激活,Gli1表達(dá)明顯上調(diào)。
　　2.2RNAi敲低GSC的Smo基因表達(dá),Western-blot檢測(cè)對(duì)GSC的HH通路活性影響,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,HH通路活性受到顯著抑制,Gli

6、1表達(dá)明顯降低。
　　2.3敲低GSC的Smo基因表達(dá)后,體外成球?qū)嶒?yàn)證實(shí),與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的GSC體外成球大小顯著小于Smo未敲低組。
　　2.4Western-blot實(shí)驗(yàn)證實(shí),與對(duì)照組相比,與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后的GL261細(xì)胞其干性基因表達(dá)上調(diào),敲低Smo基因后可明顯抑制上述作用。
　　2.5小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí),敲低Smo基因表達(dá)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)GL261細(xì)胞移植瘤的成瘤能力的促進(jìn)作用。
　　3.Bmi1基因

7、在內(nèi)皮細(xì)胞促膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性表型中起到一定作用。
　　3.1內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)GL261細(xì)胞干性表型時(shí)其Bmi1表達(dá)上調(diào)。
　　3.2RNAi技術(shù)敲低GL261的Bmi1表達(dá)后CD133陽(yáng)性比例降低(0.78%VS0.05%)。
　　3.3體外成球?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn),敲低GL261細(xì)胞Bmi1基因表達(dá)后成球體積變小。
　　4.GSC有增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力的作用。
　　4.1CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與GSC共培養(yǎng)后,內(nèi)

8、皮細(xì)胞孔450nm吸光度(0.044,0.072,0.10)在24h、48h、72h均強(qiáng)于對(duì)照組(0.033,0.046,0.064)。
　　4.2與對(duì)照組相比,劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與GSC共培養(yǎng)后的內(nèi)皮細(xì)胞在24h時(shí)愈合的速度快于對(duì)照組(270μmVS160μm)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)過(guò)的內(nèi)皮細(xì)胞在24h時(shí)遷移至小室下層的細(xì)胞數(shù)增多(260個(gè)/視野VS150個(gè)/視野)。
　　5.GSC促內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移的作用與

9、HH信號(hào)通路的激活有關(guān)。
　　5.1PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí),與對(duì)照組相比,與GSC共培養(yǎng)后內(nèi)皮細(xì)胞的Gli1基因表達(dá)上調(diào)9.5倍,Western-blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蛋白水平表達(dá)明顯提高,提示與GSC共培養(yǎng)后內(nèi)皮細(xì)胞HH信號(hào)通路激活。
　　5.2RNAi技術(shù)敲低內(nèi)皮細(xì)胞Smo基因表達(dá)后,cck-8增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其72h的吸光度和對(duì)照組相比有明顯降低(0.027VS0.020)。
　　5.3.RNAi技術(shù)敲低內(nèi)皮細(xì)胞Smo基因表達(dá)后

10、,劃痕實(shí)驗(yàn)表明,其遷移能力在8h時(shí)(84μmVS53μm)和24h時(shí)(173μmVS120μm)均比對(duì)照組顯著降低。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其遷移能力在8h(65個(gè)/視野VS22個(gè)/視野)和24h(244個(gè)/視野VS150個(gè)/視野)也均明顯降低。
　　6.內(nèi)皮細(xì)胞分泌的Shh蛋白在介導(dǎo)Hedgehog通路激活中起重要作用。
　　6.1PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,共培養(yǎng)體系中GSC和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Shh基因表達(dá)均有上調(diào)(3

11、.8倍,2.0倍)。ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系的培養(yǎng)上清液中Shh、Hhip濃度均增加。
　　6.2PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)時(shí)若敲低GSC的Shh基因則對(duì)GSC的Gli1基因上調(diào)無(wú)影響,若敲低內(nèi)皮細(xì)胞Shh基因則GSC的Gli1上調(diào)幅度顯著降低,提示內(nèi)皮細(xì)胞的Shh在激活GSC的HH通路中起到更重要的作用。
　　結(jié)論:
　　1.內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)激活hedgehog通路促進(jìn)GSC和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干性特征的表達(dá)。
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