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文檔簡介
1、一、研究背景與目的
血管內(nèi)皮細胞(VEC)是循環(huán)血液與血管平滑肌間的機械屏障。VEC的功能相當(dāng)廣泛,除起轉(zhuǎn)運屏障作用外,還具有分泌功能,可以合成分泌多種物質(zhì),對調(diào)節(jié)血管緊張度、血液流通、細胞生成、炎癥反應(yīng)、免疫等功能具有重要作用。多種因素可通過不同機制與途徑損傷血管內(nèi)皮細胞,使內(nèi)皮屏障作用減弱,血中脂蛋白過多地進入動脈壁沉積下來,被清道夫細胞吞噬形成泡沫細胞;內(nèi)皮細胞受損后,炎細胞、血小板的粘附與內(nèi)容物的釋放又加重了內(nèi)皮細胞損
2、傷,從而逐漸形成粥樣硬化斑塊,因此尋找一種應(yīng)用方便、專一性強、來源豐富、效果良好的VEC保護劑也越來越引起人們的重視。
本課題以血管內(nèi)皮細胞為靶細胞,以卵泡抑素相關(guān)蛋白(FRP)為主要研究對象,以Western Blot、Si-RNA、Rt-PCR、ChIP assay等實驗技術(shù)為研究手段,重點探討FRP對VEC的保護作用,力求闡明該蛋白對VEC的抗凋亡機制及其在動脈粥樣硬化中的病理意義。
二、材料與方法
3、1、根據(jù)驗證樣性的基因編碼序列獲得FRP編碼區(qū)cDNA連接于表達載體pET32a,構(gòu)建表達重組子,轉(zhuǎn)化入 Origami(DE3),1mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達,使用Ni-NTA His Band Resins,Sephacryl S-100純化蛋白,腸激酶酶切融合蛋白并鑒定。
2、分離臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞,并用含有胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng),每2-3天換液一次,定期進行消化傳代。
3、將C段帶有FLA
4、G標簽的FRP基因片段連接到pcDNA4/TO上,先后將pcDNA6/TR和pcDNA4/TO/FRP-FLAG轉(zhuǎn)染至內(nèi)皮細胞系EAHY926中,用blasticidin和zeocin篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細胞。
4、制備ApoE基因敲除小鼠為背景的FRP轉(zhuǎn)基因動物,ApoE基因缺陷小鼠與ApoE基因缺陷FRP轉(zhuǎn)基因小鼠,構(gòu)建動脈粥樣硬化動物模型。
5、通過PI-Annexin-V雙染后流式細胞儀分析,研究FRP重組蛋
5、白FRP抗ox-LDL誘導(dǎo)的細胞凋亡維持HUVEC的細胞活性。
6、通過rt-PCR WesternBlot等方法檢測FRP下游抗凋亡蛋白。
三、結(jié)果
1.給予ApoE缺失小鼠及ApoE基因缺陷-FRP轉(zhuǎn)基因小鼠喂養(yǎng)12周。TUNEL提示ApoE缺失小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成后血管內(nèi)皮細胞凋亡增加;ApoE基因缺陷-FRP轉(zhuǎn)基因小鼠TUNEL染色顯示凋亡的內(nèi)皮細胞顯著少于ApoE組。用oxLDL的終濃度依次為
6、0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、50ug/ml(0ug/ml oxLDL作為對照組)處理HUVECs直接影響FRP的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后HUVECs的FRP表達量與oxLDL的濃度呈反比。
2.細菌可溶性的蛋白經(jīng)Ni-His band及Sephadex Sephacryl S-100純化酶切蛋白后,得到目的蛋白。
3.用濃度為50ug/ml的ox-LDL處理HUVECs,與對照組相比細胞
7、變圓,貼壁細胞減少。100ng/ml的FRP重組蛋白可以抗ox-LDL誘導(dǎo)的細胞凋亡。MTT檢測提示,隨著ox-LDL濃度的增加,內(nèi)皮細胞的存活能力逐漸降低;不同濃度的FRP和ox-LDL對內(nèi)皮細胞進行處理時,發(fā)現(xiàn)FRP可以抵抗ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡,當(dāng)FRP濃度為100ng/ml時有顯著性差異。FRP濃度大于80ng/ml時可顯著提高細胞活性。FACS提示FRP可顯著降低凋亡早期annexin V陽性細胞數(shù)。
4.按
8、如下方法處理細胞24小時:1、空白對照組+50μg/ml LDL.2、+50μg/ml oxLDL.3、+50μg/ml oxLDL+50ng/ml FRP.4、+50μg/ml oxLDL+75ng/ml FRP.5、+50μg/ml oxLDL+100ng/ml FRP。實驗發(fā)現(xiàn),F(xiàn)RP可以上調(diào)磷酸化Akt的表達,從而激活磷酸化Akt的下游基因——磷酸化Bad的表達。然而,Akt的表達量并未隨著FRP的表達量而改變,Bcl2的表達量
9、隨著FRP濃度的增高而顯著性增加。
5.利用轉(zhuǎn)染Bcl2 siRNA的方法抑制Bcl2的蛋白表達,可使Bcl2蛋白表達量降低約50%(Scramble RNA組為對照組)。用FRP誘導(dǎo)Bcl2表達發(fā)現(xiàn)Bcl2 siRNA組與對照組相比Bcl2的表達量無明顯增加。在Scramble RNA組中可以觀察到FRP對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡仍有保護作用,而在Bcl2 siRNA組,F(xiàn)RP的保護作用喪失。
四、結(jié)論
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