白藜蘆醇抑制缺氧復氧誘導心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡的作用及機制研究.pdf

1、實驗背景及目的:
　　近幾年來,隨著心血系統(tǒng)疾病治療策略的進步以及溶栓術、血管成形術、冠脈搭橋術和器官移植等方法在臨床的應用,使缺血的心臟組織重新得到血流灌注后,可使心臟結構、功能得到恢復和改善;但有時心臟缺血后再灌注不僅使心臟功能不能恢復,而且造成心肌組織結構和功能障礙進一步加重,甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱為心肌缺血/再灌注損傷(Myocardiumischemia/reperfusioninjury,MI/RI)。心肌缺血/

2、再灌注損傷可引起心肌細胞膜結構改變、基質中致密物增多,大量的鈣沉積、線粒體水腫、膜通透性改變和細胞器斷裂溶解等超微結構的改變,這些是缺血心肌可逆性損傷向不可逆損傷的病理生理轉變過程。再灌后不但使心肌細胞發(fā)生上述的病理變化,同時導致心肌微血管內(nèi)皮細胞(Cardiacmicrovascularendothelialcell,CMEC)在形態(tài)、結構和功能發(fā)生異常的病理生理性改變,血管內(nèi)皮舒張因子(EDRF)減少和內(nèi)皮素(ET-1)增多,微血管

3、內(nèi)皮的水腫和破壞,致使血小板與白細胞黏附、聚集、栓塞,造成心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡(Apoptosis)或壞死。文獻報道,心肌缺血/再灌注損傷時,心肌微血管內(nèi)皮細胞功能和結構形態(tài)異常改變發(fā)生的時間早于心肌細胞[1],心肌微血管內(nèi)皮細胞受損引起活性氧物質的生成,釋放細胞因子、生長因子、炎性組織因子、發(fā)生脂質過氧化反應,從而加重內(nèi)皮細胞損傷、心肌組織結構和功能障礙。
　　白藜蘆醇(Resveratrol)是廣泛存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植

4、物中的一種多酚類化合物,具有抗炎、抗氧化、抑制血小板黏附、聚集,調(diào)節(jié)能量代謝等生物學保護作用[2]。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可抑制缺血缺氧誘導的心肌細胞凋亡、增強心肌組織抵抗損傷的能力,維持氧供需平衡,促進缺血心肌細胞的活力,改善心功能。近期研究證實,磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路可參與缺氧復氧誘導心肌微血管內(nèi)皮細胞病理生理性損傷的發(fā)生、發(fā)展過程,并調(diào)節(jié)細胞存活、增殖分化、細胞遷移和能量代謝等生物學作用[3];

5、缺氧誘導因子-1α(Hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)是缺氧環(huán)境下,廣泛存在于人體組織和哺乳動物體內(nèi)的一種生存轉錄調(diào)節(jié)因子,通過調(diào)控一系列與適應缺氧有關的基因的表達,促進氧轉運、血管新生、抑制細胞凋亡、生存應激和能量代謝等在保持機體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的生理學作用。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可抑制缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡[4],但是缺氧復氧前給予白藜蘆醇干預是否對心肌微血管內(nèi)皮細胞具有保護作

6、用及其作用機制否是與激活PI3K/Akt/HIF-1α信號通路有關尚未見文獻報道。
　　研究目的:
　　1.觀察不同濃度的白藜蘆醇對缺氧復氧誘導心肌微血管內(nèi)皮細胞活性和細胞凋亡的影響。
　　2.探討白藜蘆醇抑制缺氧復氧誘導心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡是否通過激活PI3K/Akt/HIF-1α信號通路而實現(xiàn)的。
　　實驗方法:
　　第一部分:白藜蘆醇預處理對缺氧復氧誘導心肌微血管內(nèi)皮細胞的影響
　　1.取SD

7、雄性大鼠心臟的左心室心肌,利用酶消化法成功分離心肌微血管內(nèi)皮細胞(CMEC),Dil-Ac-LDL與DAPI免疫熒光雙染法鑒定細胞。
　　2.建立心肌微血管內(nèi)皮細胞缺氧復氧模型,設立對照組、缺氧復氧組、不同濃度白藜蘆醇組(5、10、20、30、40μmol/L)。MTT比色法檢測心肌微血管內(nèi)皮細胞的活性,TUNE染色法檢測心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡,并確定白藜蘆醇最適實驗濃度。
　　第二部分:PI3K/Akt/HIF-1α信號通

8、路在白藜蘆醇抑制缺氧復氧誘導心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡中的作用
　　體外培養(yǎng)2-3代的心肌微血管內(nèi)皮細胞(CMEC),建立缺氧復氧細胞損傷模型,并隨機分為1)對照組2)缺氧復氧(H/R)組3)缺氧復氧(H/R)+20μmol/L白藜蘆醇組4)缺氧復氧(H/R)+20μmol/L白藜蘆醇+LY294002組。MTT比色法檢測心肌微血管內(nèi)皮細胞的活性;Transwell檢測心肌微血管內(nèi)皮細胞的遷移能力;分別以PI-AnnexinV、TUN

9、EL染色法檢測心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡;Western-blot法檢測心肌微血管內(nèi)皮細胞的P-Akt、HIF-1α蛋白表達水平。
　　實驗結果:
　　1.心肌微血管內(nèi)皮細胞鑒定:細胞質Dil-Ac-LDL染色陽性(呈紅色熒光),細胞核DAPI染色陽性(呈藍色熒光),證實體外所培養(yǎng)的細胞為心肌微血管內(nèi)皮細胞(CMEC)。
　　2.MTT、TUNEL法檢測結果表明:不同濃度(5、10、20、30、40μmol/L)白藜蘆醇均

10、可提高細胞活性,抑制細胞凋亡,中濃度的白藜蘆醇(20μmol/L)保護作用明顯(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;故選定20μmol/L白藜蘆醇作為最適實驗濃度。3.與對照組相比,缺氧復氧組P-Akt、HIF-1α蛋白表達水平升高(P<0.05);與缺氧復氧組相比,白藜蘆醇組P-Akt、HIF-1α蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);與白藜蘆醇組相比,缺氧復氧(H/R)+20μmol/L白藜蘆醇+LY294002組CMEC的活性、遷移

11、能力均明顯降低(P<0.05),細胞凋亡明顯增加(P<0.05),P-Akt、HIF-1α蛋白表達水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明白藜蘆醇抑制缺氧復氧誘導心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡可能與Ak磷酸化和上調(diào)HIF-1α蛋白表達水平有關。
　　結論:
　　1.不同濃度的白藜蘆醇可增強缺氧復氧誘導心肌微血管內(nèi)皮細胞的活性、抑制細胞凋亡,而且在一定濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴性。
　　2.白藜蘆醇可抑制心肌微血管內(nèi)