水稻病毒與介體互作研究及水稻條紋病毒編碼蛋白功能研究.pdf

1、水稻病毒病是水稻生產(chǎn)上一類重要的病害，廣泛發(fā)生在我國水稻種植的地區(qū)。水稻病毒主要由稻飛虱等昆蟲介體傳播。伴隨著稻飛虱的爆發(fā)，水稻病毒病流行危害，對糧食生產(chǎn)造成了極大威脅。本研究中探索了水稻病毒和其傳播介體之間的聯(lián)系;研究了水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）的沉默抑制子和運動蛋白兩個關鍵蛋白的作用機制，旨在為更好地防治水稻病毒的危害提供幫助。
　　 1白背飛虱轉錄組及感染SRBSDV后基因表達差異比較

2、>　　 運用新一代測序技術，構建了白背飛虱攜帶南方黑條矮縮病毒（Southern riceblack-streaked dwarf virus, SRBS DV）以及不帶毒的文庫，比較了帶毒以后介體白背飛虱的基因表達的差異。得到了白背飛虱81388個不同的Unigene;通過和已報道的灰飛虱和褐飛虱轉錄組信息比較，發(fā)現(xiàn)三者具有非常類似的基因功能分類。通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)在白背飛虱里存在7291個簡單重復序列。通過比較帶毒后和不帶毒白

3、背飛虱基因表達的差異，發(fā)現(xiàn)SRBSDV感染介體白背飛虱后會影響其初級代謝以及泛素化介導的蛋白酶降解途徑，發(fā)現(xiàn)5.5％細胞骨架系統(tǒng)相關的基因表達發(fā)生了變化，還發(fā)現(xiàn)白背飛虱的免疫系統(tǒng)及RNA干擾途徑隨著病毒的侵染會被激活。研究結果首次闡述了呼腸孤病毒科植物病毒與其介體之間的關系，為研究水稻重要病害的傳播以及致病機制提供了依據(jù)。
　　 2 RSV編碼的NS3蛋白的灰飛虱互作蛋白RPN3的鑒定
　　 構建了灰飛虱的cDNA文庫，

4、采用酵母雙雜交的手段篩選到了一個26S蛋白酶系統(tǒng)的亞基RPN3能夠和NS3互作，并且通過體外Pull-down的試驗進行了驗證。NS3是病毒沉默抑制子，具有不依賴序列特異性的dsRNA結合活性，首先利用植物系統(tǒng)研究了RPN3對NS3沉默抑制功能的影響，發(fā)現(xiàn)兩者的互作對NS3沉默抑制子功能沒有影響。利用酵母系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)灰飛虱的RPN3能夠互補酵母RPN3突變的菌株的“活性”;當同NS3一起轉化時，灰飛虱互補酵母突變型的能力大大下降，不僅影響了

5、總蛋白的泛素化水平，而且對其泛素化蛋白降解途徑的蛋白降解能力也有很大的破壞。推測NS3和RPN3互作直接影響了RPN3參與形成蛋白酶復合體的能力。克隆了RPN3的一個433位氨基酸由異亮氨酸(I)突變?yōu)樘K氨酸(T)的點突變體，該突變不能和NS3互作，但是不影響其互補酵母RPN3突變體的能力。當突變體RPN3和NS3共同轉化到酵母突變體時，NS3對其互補突變體活性的影響不大，為NS3通過互作影響RPN3功能提供了直接證據(jù)。發(fā)現(xiàn)當利用dsR

6、NA介導的基因沉默技術使RPN3基因表達受到抑制時，帶毒的灰飛虱體內(nèi)病毒含量會逐漸上升，說明蛋白酶系統(tǒng)是抵抗RSV的一個重要方式。當沉默RPN3后，灰飛虱會因為體內(nèi)病毒含量上升而增加傳毒能力。
　　 突變體分析發(fā)現(xiàn)NS3能夠和RPN3的C段互作，這種互作不僅需要26S蛋白酶調控亞基的C末端保守區(qū)域還需要PCI domain的末端一部分。我們發(fā)現(xiàn)的433位異亮氨酸(I)突變?yōu)樘K氨酸(T)的點突變體即位于RPN3的C末端。在江蘇鹽城

7、分離的灰飛虱中發(fā)現(xiàn)存在RPN3433位異亮氨酸(I)突變?yōu)樘K氨酸(T)的點突變體，說明在自然進化中該類點突變是有意義的。泛素化蛋白酶系統(tǒng)是生物最重要的系統(tǒng)，RSV編碼的NS3蛋白能夠通過直接和RPN3互作而影響其功能，從而有利于病毒自身，但是對灰飛虱來說病毒的過度繁殖是不利的。因此在長期進化中，RSV高發(fā)地區(qū)選擇壓造成灰飛虱進化出一些逃避機制，本研究在灰飛虱中發(fā)現(xiàn)的RPN3點突變即是寄主在不影響蛋白酶功能的基礎上逃避RSV不利影響的重要

8、方式。
　　 3 RSV在三種寄主中產(chǎn)生小RNA的多樣性分析及介體灰飛虱中存在RNA干擾介導的抗病毒的證實
　　 小RNA介導的基因沉默在植物以及無脊椎動物抵抗病毒侵染中發(fā)揮了重要作用。之前已經(jīng)有很多植物病毒侵染寄主植物后產(chǎn)生小RNA的報道，但是沒有同一種植物病毒侵染植物寄主以及在傳播介體昆蟲中產(chǎn)生小RNA的多樣性的報道。
　　 水稻條紋病毒(RSV)除了能夠在水稻及傳播介體灰飛虱中復制外，還能夠系統(tǒng)侵染本氏煙。

9、運用大規(guī)模深度測序的方法研究了RSV侵染傳播介體灰飛虱，水稻以及本氏煙后在三種寄主中產(chǎn)生小RNA的群體差異情況。還首次克隆了灰飛虱中RNA干擾相關的原件如Dicers和Agronautes，并發(fā)現(xiàn)這些元件在三種稻飛虱中都很保守，揭示了該基因家族在昆蟲進化中的功能保守性。運用雙鏈RNA顯微注射沉默基因的方法，發(fā)現(xiàn)當沉默Ago2基因表達后，RSV在灰飛虱中積累上升，為RNA干擾在介體灰飛虱抵抗RSV中發(fā)揮重要作用提供了直接證據(jù)。
　　

10、 4 RSV NSvc4在本氏煙胞間運動及在癥狀形成中的作用
　　 RSV編碼的NSvc4是該病毒的運動蛋白。為了更好的了解該運動蛋白的定位性質以及運動機制，對該蛋白進行了深入地研究。
　　 發(fā)現(xiàn)NSvc4蛋白是利用寄主的微絲系統(tǒng)以及內(nèi)質網(wǎng)系統(tǒng)到達胞間連絲(PD)，當用Lat B和BFA分別破壞本氏煙的微絲和內(nèi)質網(wǎng)系統(tǒng)后，瞬時表達NSvc4-GFP，到達胞間連絲的點刻狀顆粒明顯減少，而破壞微管后基本上對胞間連絲定位沒有

11、影響。當用化學藥劑Lat B破壞本氏煙的微絲后，RSV侵染本氏煙的效率明顯降低，證實了微絲系統(tǒng)而不是微管在RSV侵染寄主中發(fā)揮重要作用。通過軟件預測發(fā)現(xiàn)NSvc4的106到125區(qū)域有一個跨膜的結構域，當突變該區(qū)域后NSvc4到達PD的數(shù)量明顯減少，有很多點顆狀的聚集體在胞內(nèi)聚集，說明跨膜結構對NSvc4運動是必需的，也證實了NSvc4到達PD需要通過細胞內(nèi)膜系統(tǒng)的運輸。
　　 除了在胞間連絲發(fā)現(xiàn)有定位外，也發(fā)現(xiàn)NSvc4也能定

12、位到葉綠體以及葉綠體外周;突變體分析發(fā)現(xiàn)NSvc4的N端1-73個氨基酸就足以使MP定位在葉綠體。當NSvc4在PVX表達載體上表達浸潤本氏煙后，會比對照產(chǎn)生更嚴重的花葉以及壞死等現(xiàn)象;電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其侵染的植物葉綠體膜有褶皺和突起，葉綠體膜受到了破壞。突變體分析發(fā)現(xiàn)NSvc4產(chǎn)生癥狀的區(qū)域和葉綠體定位沒有直接關聯(lián)。另外，將NSvc4在昆蟲細胞（Spodoptera frugiperda9，sf-9）中表達發(fā)現(xiàn)其主要定位在細胞外周;不能產(chǎn)

13、生管狀結構，說明其運動方式和其進化上相近的另外一種負義植物病毒番茄斑萎病毒存在差異。
　　 5 RSV沉默抑制子NS3蛋白抑制基因沉默機理研究
　　 RSV編碼的NS3是沉默抑制子，但是還不清楚NS3蛋白是通過何種方式發(fā)揮沉默抑制作用的。已發(fā)現(xiàn)一些抑制子蛋白質中一些帶正電荷的氨基酸能夠以靜電吸引結合具有磷酸基團負電荷的核酸分子（如siRNA），從而阻斷基因沉默路徑，為了驗證NS3結合siRNA的能力與基因沉默抑制功能之間

14、的聯(lián)系以及明確NS3結合siRNA的區(qū)域，將NS3蛋白中保守位點的11個帶正電荷氨基酸突變?yōu)楦拾彼岬炔粠щ姾傻陌被?，然后構建到植物表達載體中和野生型NS3分別浸潤普通本氏煙和轉基因本氏煙16c上驗證抑制子活性。發(fā)現(xiàn)抑制子的活性與NS3蛋白結合siRNA能力大小密切相關，將173-175的KKR突變了為AAA后，NS3結合siRNA的能力下降1000倍，在植物體內(nèi)NS3的沉默抑制功能幾乎完全消失。證實了NS3蛋白是通過劫持siRNA干擾