水稻條紋病毒功能蛋白與其自身編碼蛋白及水稻蛋白間的互作.pdf

1、水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的水稻條紋葉枯病是水稻上的一種重要病毒病，該病在我國的分布極為廣泛，并已經給農業(yè)生產帶來嚴重的損失。RSV是一種多組分RNA病毒，其基因組由4種單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)組成，它們共編碼7個蛋白，包括RNA的RNA聚合酶(RdRp)、NS2、NSvc2、CP、NS3、SP、NSvc4。 本文以RSV NSvc4為誘餌蛋白，在“武育

2、粳3號自然突變體”文庫上篩選到的NB15(brown planthopper-induced resistance protein1 contains CBS domain)、在“武育粳3號”文庫篩選到的NW1(CI2E contains InterPro domain(s)；Potato inhibitorⅠ family)蛋白作為對象，對它們與CP、SP、NSvc4之間的相互作用進行驗證。提取水稻RNA，通過RT-PCR擴增獲得了水

3、稻NB15和NW1完整基因，分別將其與酵母雙雜交捕獲載體pGADT7相連，構建重組子pGAD-NB15、pGAD-NW1。將pGAD-NB15和pGAD-NW1分別與構建好的重組子誘餌質粒pGBK-NSvc4、pGBK-CP、pGBK-SP兩兩共轉化到酵母菌AH109中，轉化產物涂布于不同的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基平板，從而檢測NB15和NW1全長基因表達產物與RSV CP、SP和NSvc4的互作情況。結果表明蛋白NB15、NW1均能與NSvc

4、4蛋白發(fā)生互作，與CP、SP均不能產生互作。 設計特異引物，利用熒光定量PCR技術檢測水稻基因NB15與NW1的mRNA在健康水稻葉片和受RSV侵染的水稻葉片中的表達量情況。比較mRNA的表達量差異，從而分析RSV侵染及病毒蛋白與寄主蛋白互作對mRNA的影響。結果表明，NB15的mRNA在RSV侵染后的水稻中與在健康水稻中的表達量相比表現(xiàn)為下調；NW1的mRNA表達量在RSV侵染后的水稻中與在健康水稻中的表達量相比表現(xiàn)為上調。

5、 構建了水稻基因NB15的融合蛋白原核表達載體，并在大腸桿菌(Escherichia coil)BL21中得以表達，SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)測定融合蛋白的分子量約為27KDa。割膠純化蛋白，分多次間隔免疫健康公家兔，制備了His-NB15抗血清，運用ELISA技術檢測其效價(1：12800)，并通過Western-blot印跡表明，它與水稻葉片總蛋白有很強的免疫性，但健康水稻中檢測NB15較病葉中的含量低：制

6、備的NBl5抗血清，可用于后續(xù)的免疫膠體金及細胞定位研究。 研究水稻條紋病毒基因組RNA編碼的NS3蛋白與其他基因組分編碼的蛋白SP、CP、NSvc4之間的互作。RT-PCR擴增目的基因NS3，構建酵母表達載體，將其分別與酵母誘餌載體pGBKT7與酵母捕獲載體pGADT7相連，得到重組子pGAD-NS3、pGBK-NS3。自身毒性的實驗結果表明，NS3蛋白對酵母細胞無毒性和自身激活活性，也不存在自身互作。將這兩個重組子分別與CP