灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒(RSV)互作因子的篩選及其功能分析.pdf

1、近年來，水稻條紋葉枯病在我國廣大稻區(qū)暴發(fā)流行，對水稻生產(chǎn)構(gòu)成極大威脅。該病是由灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallén）傳播水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的，病毒能在灰飛虱體內(nèi)循回并增殖，并由灰飛虱以持久方式經(jīng)卵傳播。水稻條紋葉枯病的流行和暴發(fā)與灰飛虱的廣泛發(fā)生有著非常密切的關(guān)系。因此，了解灰飛虱對RSV的?；宰R別和傳播機制是防治該病害的關(guān)鍵。目前，灰飛虱傳播RSV機制的研究主

2、要集中在傳統(tǒng)生物學(xué)水平，其分子機制還不清楚，有待更深層次的研究。為了闡明灰飛虱傳播RSV的機制，本論文從灰飛虱體內(nèi)RSV特異性互作因子等角度展開了研究。
　　 水稻條紋病毒7個基因在水稻和灰飛虱體內(nèi)表達(dá)量分析:
　　 利用Real time Q-PCR分析比較了RSV全部7個基因在感病水稻和帶毒灰飛虱體內(nèi)的表達(dá)豐度。結(jié)果顯示，沉默抑制子NS3基因在水稻和灰飛虱體內(nèi)均為最高表達(dá)水平，NS3基因的高豐度表達(dá)說明RSV侵入寄主

3、細(xì)胞后，必須首先抑制寄主的免疫系統(tǒng)，以保證自身的復(fù)制，但同樣作為沉默抑制子的NS2基因在兩類寄主內(nèi)的表達(dá)量都不高，NS3和NS2如何協(xié)調(diào)沉默抑制功能值得進(jìn)一步研究。病害特異性蛋白SP基因僅在水稻中高豐度表達(dá)，在灰飛虱體內(nèi)表達(dá)量相對偏低。與復(fù)制酶RdRP基因在灰飛虱體內(nèi)的極低表達(dá)量（NCP基因的0.2倍）相比，RdRP基因在水稻中的表達(dá)量相對較高（NCP基因的0.8倍），這暗示RSV在水稻中的復(fù)制可能要比在灰飛虱體內(nèi)更加強烈。
　　

4、 5個灰飛虱蛋白涉及水稻條紋病毒與介體的互作:
　　 以實驗室多代篩選獲得的高親和性無毒灰飛虱群體為材料，采用雙向電泳（2-DE）分離灰飛虱總蛋白，通過病毒覆蓋測定(virus overlay assay)從灰飛虱總蛋白中篩選出5個能與RSV病毒粒子特異性結(jié)合的蛋白因子。對互作因子進(jìn)行鈉升高效液相色譜-電噴霧碰撞誘導(dǎo)解離串聯(lián)質(zhì)譜法(Nano LC-ESI-CID-MS/MS)測定，5個蛋白分別鑒定為有活性的蛋白激酶C受體（th

5、e receptor for activated protein kinase C，RACK）、60S核糖體蛋白L5（60S ribosomal protein L5，RPL5）、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH3)、60S RPL7a和60S RPL8。以質(zhì)譜鑒定獲得的蛋白肽序列標(biāo)簽檢索灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，得到蛋白的部分序列信息，進(jìn)一步克隆了5個互作蛋

6、白因子的全長基因。對5個蛋白因子進(jìn)行互作功能驗證，酵母雙雜交實驗顯示，RACK和GAPDH3與RSV-NCP無互作關(guān)系，RpL5、RpL7a和RpL8與RSV-NCP存在較強的互作關(guān)系;將5個互作蛋白進(jìn)行了蛋白表達(dá)，并通過表達(dá)蛋白的體外病毒結(jié)合實驗（far-Western blot和DIBA）分析5個互作蛋白的病毒結(jié)合能力，far-Western blot的結(jié)果與酵母雙雜交一致，斑點免疫檢測(DIBA)顯示5個蛋白對RSV粒子均有結(jié)合能

7、力。結(jié)論:RACK和GAPDH3（已證實為蚜蟲的傳毒biomarker）與病毒的互作可能依賴于蛋白在膜系統(tǒng)中的特殊構(gòu)象，推測參與病毒的跨細(xì)胞作用;3個核糖體蛋白（RpL5、RpL7a和RpL8）可能參與RSV在灰飛虱體內(nèi)的增殖。
　　 灰飛虱高帶毒（RSV）群體酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及NCP互作因子的篩選:
　　 以實驗室篩選的灰飛虱高親和性高帶毒群體（簡稱高帶毒群體）為材料，分離純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDN

8、A，連接三框型接頭并純化。采用同源重組反應(yīng)制備三框型cDNA入門文庫，再通過gateway策略將入門文庫轉(zhuǎn)移到兼容載體pGADT7-DEST，構(gòu)建獲得酵母雙雜交cDNA文庫。檢測結(jié)果表明:文庫庫容量為3.68×107 cfu，擴增文庫滴度為2.62×1010 cfu/mL;文庫重組率大于95％，cDNA插入片段平均長度＞1 kb，達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫的要求?；绎w虱高帶毒群體酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建為開展昆蟲介體與水稻條紋病毒互作機

9、制的研究奠定了基礎(chǔ)。建庫完成后，以RSV-NCP蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選cDNA文庫，從中釣取能夠與NCP蛋白互作的灰飛虱蛋白。經(jīng)測序分析，共獲得13個RSV互作蛋白，結(jié)合已有的文獻(xiàn)報道，對這些蛋白在病毒與介體互作過程中的作用進(jìn)行了初步推測。
　　 灰飛虱內(nèi)生病毒HiPV與RSV傳播相關(guān)性初探:
　　 以寄（共）生微生物為突破口，研究內(nèi)生病毒HiPV（Himetobi P virus）對灰飛虱傳播RSV的影響。

10、利用大腸桿菌系統(tǒng)和pET系列載體表達(dá)了HiPV外殼蛋白VP1，經(jīng)Ni-NTA樹脂親和層析柱純化了VP1蛋白，并免疫家兔制備了抗體。Western-blot結(jié)果顯示，能夠從灰飛虱體內(nèi)特異地檢測出HiPV?；赗T-PCR和Western-blot方法，建立了單頭灰飛虱HiPV檢測體系，并檢測不同類型的灰飛虱群體中HiPV的感染情況，對內(nèi)生病毒HiPV與RSV傳播之間的相關(guān)性進(jìn)行了初步分析。結(jié)果顯示，HiPV在灰飛虱高親和性群體內(nèi)廣泛存在，

11、灰飛虱攜帶RSV與體內(nèi)感染HiPV存在一定的對應(yīng)關(guān)系。酵母雙雜交分析顯示RSV-NCP與HiPV外殼蛋白VP1存在較強互作關(guān)系。根據(jù)當(dāng)前的研究結(jié)果，提出了一個研究假說，即灰飛虱高親和性群體對RSV具有高親和性的主要原因，是灰飛虱體內(nèi)感染了昆蟲病毒HiPV。這將有助于從灰飛虱體內(nèi)寄（共）生微生物角度研究灰飛虱傳毒機制。
　　 RSV編碼的NSvc2蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測和驗證:
　　 RSV與番茄斑萎病毒(TSWV)在進(jìn)化上存在著

12、較近的親緣關(guān)系，并且RSV與TSWV在基因組結(jié)構(gòu)和功能方面存在對應(yīng)性。RSV編碼的NSvc2蛋白與TSWV的膜糖蛋白（參與薊馬傳播的決定因子）相對應(yīng)，因此推測NSvc2蛋白為RSV參與灰飛虱傳播的決定因子。對NScv2蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，并繪制NSvc2蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖，預(yù)測NSvc2為糖蛋白，在寄主體內(nèi)存在切割現(xiàn)象，被切割成2個蛋白R-GN/R-GC行使功能。經(jīng)Western-blot分析驗證，NSvc2在水稻中被切割成2個蛋白