水稻條紋病毒NS2、NS3蛋白與寄主間的互作.pdf

1、水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)是纖細病毒屬的代表種,由RSV引起的水稻條紋葉枯病近年來在我國多次爆發(fā)流行,給我國的水稻生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者多年來的研究,RSV編碼蛋白的功能、致病性分化、遺傳多樣性、病毒與寄主間的互作以及病害的防治都有了一定的認識。為了控制病害的發(fā)生,促進我國水稻生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展,需要深入地了解病毒與水稻、介體昆蟲三者之間的互作關(guān)系。
　　 本文利用酵母雙雜交技術(shù)研

2、究了RSVNS2、NS3蛋白與寄主水稻間的互作,獲得了一些陽性克隆。為進一步確定獲得的陽性克隆基因所編碼的全長蛋白是否能與NS2或NS3互作,選取了與NS2互作的5個基因,與NS3互作的3個基因片段進行全長擴增,并構(gòu)建至酵母表達載體pGADT7,分別與NS2或NS3共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,通過不同的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選,確定全長蛋白與NS2或NS3互作情況。結(jié)果表明,完整水稻果膠酶蛋白(pectinesterase)、Ras相關(guān)蛋白(r

3、as-related protein)、膽堿磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(cholinephosphatecytidylyltransferase)、水稻基因沉默抑制子3(suppressor of gene silencing3,SGS3)及一功能未知蛋白均能與NS2互作,完整水稻UBA/TS-N域包含蛋白(UBA/TS-Ndomain containing protein)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phospha

4、tedehydrogenase,GAPDH)能夠與NS3互作,而完整蛋白O-甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferase)不能與NS3互作,且水稻SGS3(OsSGS3)蛋白也能夠與NS3互作。水稻SGS3(OsSGS3)蛋白與擬南芥SGS3蛋白同源,為研究NS2、NS3與水稻SGS3互作的關(guān)鍵區(qū)段,根據(jù)OsSGS3的保守結(jié)構(gòu)域?qū)⑵浞譃?段,分別為包含Zinc結(jié)構(gòu)域的SGS3-1區(qū)段、包含XS結(jié)構(gòu)域的SGS3-2區(qū)段、包含Coil

5、ed coil結(jié)構(gòu)域的SGS3-3區(qū)段,并與NS2或NS3共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,通過不同的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選互作的區(qū)段。結(jié)果表明NS2、NS3均可以與這3個區(qū)段互作,但NS2與SGS3-3區(qū)段的互作較弱。
　　 雙分子熒光互補研究表明在煙草葉片細胞中NS3與水稻GAPDH(OsGAPDH)、NS2與OsSGS3存在的互作。亞細胞定位研究表明OsGAPDH主要定位于細胞質(zhì)中,OsSGS3定位于細胞質(zhì),而NS2定位于細胞核和細胞

6、膜,且在膜上形成小點結(jié)構(gòu),在核內(nèi)能定位于柯浩體。OsSGS3與NS2主要共定位于細胞核,推測NS2改變了OsSGS3的定位,進而干擾其功能。免疫共沉淀結(jié)果也表明NS2與OsSGS3存在互作。擬南芥SGS3在小RNA生成過程中發(fā)揮作用,為研究NS2與OsSGS3互作的可能功能,首先通過熒光定量PCR檢測了相關(guān)反式作用小RNA的靶標基因(5個生長素應(yīng)答因子)表達量變化。結(jié)果表明,RSV侵染水稻后5個生長素應(yīng)答因子表達量上調(diào),表明RSV侵染后

7、水稻反式作用小RNA途徑可能受到影響。為此進一步檢測了相應(yīng)反式作用小RNA的表達量變化,結(jié)果表明小RNA表達量相對于健康水稻上升了2倍,推測可能是水稻的反饋調(diào)節(jié)作用造成的。進一步對OsSGS3、反式作用siRNA前體TAS3基因表達量進行了檢測,結(jié)果表明OsSGS3基因表達量上調(diào)了2.7倍,TAS3基因表達量上調(diào)了3倍。
　　 以灰飛虱(Laodelphax striatellus)mRNA為起始模板,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建

8、了灰飛虱酵母雙雜交cDNA文庫。經(jīng)過檢測表明:構(gòu)建的初級cDNA文庫的庫容量為1.85x107cfu;擴增文庫滴度為7.7x108cfu/mL,重組率約為97％;擴增文庫插入片段主要集中在1000-1500 bp之間。隨機挑取10個克隆,測序后與GenBank數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示7個克隆具有同源序列,其中L2、L9為已公布的灰飛虱序列?；绎w虱酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建為克隆全長目的基因及研究灰飛虱與其傳播的水稻病毒問的互作奠定了基礎(chǔ)。構(gòu)

9、建了包含RSV NS3的酵母表達載體pDB-NS3,以NS3為誘餌篩選了灰飛虱cDNA文庫,釣取與之互作的灰飛虱蛋白。首先將酵母表達載體pDB-NS3轉(zhuǎn)化酵母菌MaV203,以含有pDB-NS3的酵母菌制備酵母感受態(tài),采用順序轉(zhuǎn)化法篩選灰飛虱cDNA文庫,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別涂布不同的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基,觀察酵母菌生長情況并檢測B半乳糖苷酶活性。結(jié)果表明,以NS3為誘餌共篩選獲得4個陽性克隆,序列比對表明只有一個克隆具有正確讀碼框,且與一些昆蟲的