水稻條紋病毒脅迫下抗感品種的差異蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、由水稻條紋病毒(Rice stripe tenuivirus，RSV)引起的條紋葉枯病是一種重要病毒病害，給我國水稻生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的影響。病毒的侵染和寄主的防御是一個相互博弈的過程。為了完成自身的生命活動，病毒需要招募大量的寄主蛋白。而為了抵御病毒的入侵，植物則會產(chǎn)生大量的抗病相關(guān)蛋白，因此病毒與寄主間存在著復(fù)雜的互作關(guān)系，這種關(guān)系在蛋白質(zhì)層面上則表現(xiàn)為蛋白質(zhì)組的變化。因此，研究植物受病毒侵染影響的差異蛋白質(zhì)組能夠由表及里的闡明植物的抗病

2、反應(yīng)、癥狀形成機(jī)制等問題。
　　本文利用iTRAQ技術(shù)分析了RSV侵染對高抗和高感水稻品種蛋白質(zhì)組的影響，結(jié)果表明:高抗品種(鎮(zhèn)稻88)共有541個蛋白發(fā)生了下調(diào)表達(dá)，496個蛋白發(fā)生了上調(diào)表達(dá);在高感病品種（武育粳3號）則有544個下調(diào)表達(dá)蛋白和509個上調(diào)表達(dá)蛋白;其中兩個品種共有的下調(diào)和上調(diào)表達(dá)蛋白分別有213個和207個。進(jìn)一步通過RSV侵染后抗、感品種中上調(diào)蛋白的差異倍數(shù)的比對，獲得了25個誘導(dǎo)性抗病相關(guān)蛋白。為了解誘導(dǎo)

3、性抗病相關(guān)蛋白的功能及所參與的抗病反應(yīng)，利用UniProt對其進(jìn)行了GO注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與了活性氧代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、細(xì)胞的程序性死亡、翻譯后修飾、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)增強(qiáng)等生命過程。
　　通過對下調(diào)表達(dá)蛋白的生物信息分析發(fā)現(xiàn)，葉綠體蛋白受病毒侵染影響最大，其中包括牻牛兒基牻牛兒基二磷酸還原酶(Geranylgeranyl diphosphate reductase)、原葉綠素酸酯還原酶B(Protochloroph

4、yllide reductase B)、鎂離子螯合酶D亞基(Magnesium-chelatase subunit ChlD，CHLD)、氧依賴性糞卟啉原-Ⅲ氧化酶(Oxygen-dependent coproporphyrinogen-Ⅲ oxidase)、尿原卟啉原脫羧酶2（Uroporphyrinogen decarboxylase2）和谷氨酸-1-半醛2，1-氨基變位酶（Glutamate-1-semialdehyde2，1-a

5、minomutase）等在內(nèi)的9個蛋白參與了葉綠素的生物合成過程;包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞基(Ribulose bisphosphate carboxylase small chain)、細(xì)胞色素f(Cytochromef，Cytf)、葉綠體光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心亞基i1樣蛋白Ⅰ(Chloroplast photosystemⅠ reactioncenter subunitⅡ-like protein，PSI-D)、葉綠體中的NAD

6、(P)H醌氧化還原酶亞基4L(NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit4L)和葉綠體中的NAD(P)H醌氧化還原酶亞基J(NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit J）等在內(nèi)的9個蛋白參與了光合作用。這些蛋白的下調(diào)表達(dá)可能導(dǎo)致寄主葉綠素的生物合成以及光合作用的受阻，從而導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞，使植株表現(xiàn)出黃化、褪綠等病害癥狀。
　　為明確差異表達(dá)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上

7、的差異，本文從上調(diào)表達(dá)蛋白中選擇了微管蛋白α-1鏈（Tubulin alpha-1 chain）、多糖基二糖寡糖-蛋白質(zhì)糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B(Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit STT3B)、谷蛋白毒素-C6(Glutaredoxin-C6)，Os02g0586400蛋白、銅-鋅超氧化物歧化酶Ⅰ(Superoxide dismut

8、ase[Cu-Zn]1)以及可能的Ⅴ型質(zhì)子ATP酶亞基H(ProbableⅤ-type proton ATPase subunit H)等6個可能與抗病反應(yīng)的相關(guān)蛋白基因，從下調(diào)表達(dá)蛋白中選擇了光系統(tǒng)Ⅰ P700葉綠素a載脂蛋白A1(PhotosystemⅠ P700 chlorophyll a apoprotein A1)、細(xì)胞色素b6-f復(fù)合鐵硫亞基(Cytochrome b6-fcomplex iron-sulfur subuni

9、t)、葉綠素還原酶B(Protochlorophyllide reductase B)以及鎂離子螯合酶D亞基（Magnesium-chelatase subunit ChlD）、可能的Ⅴ型質(zhì)子ATP酶亞基H（ProbableⅤ-typeproton ATPase subunit H)等4可能與癥狀形成相關(guān)的蛋白基因進(jìn)行了RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果表明這10個蛋白在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上差異趨勢一致，說明了iTRAQ結(jié)果可靠。
　　為進(jìn)

10、一步探索水稻條紋葉枯病的癥狀形成機(jī)制，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選了與鎂離子螯合酶D亞基(CHLD)互作的病毒組分，結(jié)果表明，RSV的特異性蛋白(SP)能夠與CHLD發(fā)生互作。隨后構(gòu)建了CHLD的超表達(dá)載體，并進(jìn)行水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了33棵CHLD超表達(dá)植株，為了進(jìn)一步探索CHLD在癥狀形成中的作用準(zhǔn)備了實(shí)驗(yàn)材料。
　　此外，利用高通量測序技術(shù)鑒定了貴州貴陽辣椒病毒病原，發(fā)現(xiàn)黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaic virus，CM

11、V)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、蠶豆萎蔫病毒2號(Broad beanwilt virus2，BBWV2)、辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)和辣椒內(nèi)源RNA病毒(Bell pepper endornavirus，BPEV)等多種病毒復(fù)合侵染是導(dǎo)致辣椒病毒病嚴(yán)重發(fā)生的主要原因。同時建立了BBWV2、ChiVMV、CMV和PVY四種辣椒病毒和小西葫蘆黃花葉病毒(

12、Zucchiniyellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、甜瓜蚜傳黃化病毒(Melon aphid-borneyellows virus，MABYV)、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottlemosaic virus，CGMMV)和西瓜隱潛病毒(Citrullus lanatus cryptic virus，CiLCV)等五種西瓜病毒