基于miRNA和siRNA策略抗水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒的研究.pdf

1、水稻是我國重要的糧食作物之一，種植面積約占糧食播種總面積的30％，產(chǎn)量接近糧食總產(chǎn)量的44%。稻米品質好，價值高，是我國主要的商品糧食，亦是發(fā)酵工業(yè)的重要原料。水稻病害是限制水稻進一步提高產(chǎn)量和品質的主要瓶頸之一。水稻條紋葉枯病（Rice stirp disease）和水稻黑條矮縮?。≧ice black-streaked dwarf disease）是在水稻生產(chǎn)中普遍發(fā)生的、危害嚴重的病毒病害。發(fā)病嚴重時，感病植株死亡，最終導致水稻產(chǎn)

2、量明顯降低，甚至絕產(chǎn)；即使存活到成熟，也表現(xiàn)為生長嚴重受阻，對水稻生產(chǎn)造成嚴重損失；并且兩種病毒病均是由灰飛虱持久性傳播的，在田間，這兩種病害可以同時發(fā)生，加重發(fā)病癥狀，對水稻生產(chǎn)造成更加嚴重的危害。
　　RNA沉默（RNA silencing）是一種廣泛存在于植物、動物、線蟲和真菌等真核生物中，由雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）引發(fā)的，通過序列特異性的相互作用來抑制基因表達的現(xiàn)象，被認為是真核生物阻止

3、病毒、轉座子等外來核酸的入侵，維持生物基因組穩(wěn)定性的重要防御機制。其中，小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是沉默RNA的最主要組成部分。利用RNA干擾技術培育抗病毒的轉基因植物是目前常用的一種抗病毒基因工程策略，通常稱為RNA介導的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance，RMVR）。其中，利用人工合成microRNA（artif

4、icial miRNA，amiRNA）的RNA介導病毒抗性策略培育抗病毒轉基因植物取得了很大進展，具有抗性表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特點，被認為是一種具有較大應用價值的植物抗病毒基因工程策略。此外，隨著對RNA介導的病毒抗性的不斷研究，利用RNAi策略防治病毒病已經(jīng)不止局限于培育獲得高病毒抗性的轉基因植物。目前，有研究表明，給傳毒昆蟲介體飼喂dsRNA，可以使昆蟲介體失去傳毒能力。這種防控病毒病的方法主要是切斷植物病毒的傳播

5、途徑，不需要產(chǎn)生轉基因植物就可以達到防治病毒的目的，更加具有生物安全性。
　　本研究以水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）和水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）為實驗材料，利用嵌合人工miRNA策略，培育獲得了具有較高抗病水平且能夠穩(wěn)定遺傳的雙抗RSV和RBSDV轉基因水稻新材料；以灰飛虱和RSV為實驗材料，利用RNA沉默技術，對可能參與昆蟲介體傳播病

6、毒的相關蛋白進行了功能驗證，在此基礎上，利用RNAi對昆蟲體內的傳毒相關蛋白進行基因沉默，阻斷昆蟲對病毒的傳播，減輕病毒對作物的危害。雙抗病毒轉基因水稻新材料的獲得，為我們進一步將現(xiàn)代生物技術與傳統(tǒng)育種技術相結合培育抗病毒水稻新品種奠定了基礎；介體傳毒相關蛋白的鑒定，為我們進一步高效地利用RNA沉默技術控制病毒病的危害提供重要依據(jù)。主要研究結果和結論如下：
　?。?）基于amiRNA策略培育雙抗RSV和RBSDV轉基因水稻新材料<

7、br>　　基于amiRNA抗病毒策略，選取水稻內源的osa-MIR528作為前體，利用WMD網(wǎng)站設計靶向于RSV及RBSDV的CP基因及其3′-UTR區(qū)上的有效amiRNA；然后選擇了分別靶向于RSV和RBSDV的CP基因中間片段、3′端、3′-UTR區(qū)域的3個amiRNA（分別命名為 amiR-RSVM，amiR-RSV3，amiR-RSVU和amiR-RBSDVM，amiR-RBSDV3，amiR-RBSDVU）。利用重疊PCR（o

8、verlap PCR）將其替換掉osa-MIR528自身的miRNA有效片段；然后嵌合連入改造好的pCAMBIA1300表達載體，獲得了能同時靶向于RSV和RBSDV的3個amiRNA前體二聚體植物表達載體（pamiR-M，pamiR-3和pamiR-U）。
　　將構建好的3個植物表達載體導入農桿菌EHA105，瞬時侵染本生煙驗證其有效性，3d后amiRNA的Northern分析結果表明，構建好的amiRNA植物表達載體在侵染的本

9、生煙體內能有效地表達，產(chǎn)生成熟的amiRNA，并下調靶基因的表達。5′-RLM-RACE實驗表明，amiRNA能精確介導靶基因序列的剪切。
　　通過農桿菌介導的基因轉化方法轉化臨稻10愈傷組織，經(jīng)除草劑PPT篩選和PCR檢測，分別獲得含有pamiR-M，pamiR-3和pamiR-U的T0代轉基因植株為35株、37株、48株；轉基因植株內，各類改造后的pre-amiRNA均能被識別，并表達產(chǎn)生成熟的amiRNA。
　　T0代

10、轉基因植株經(jīng)過連續(xù)自交，結合除草劑抗性檢測和PCR鑒定，獲得T2代植株。T2代轉基因植株病毒抗性鑒定結果顯示，各轉基因株系都表現(xiàn)出了對 RSV和RBSDV的不同程度的抗性，包含pamiR-M，pamiR-3和pamiR-U的轉基因株系對RSV的抗病率分別為29.52%，44.14%和54.17%；對 RBSDV的抗病率分別為26.66%，36.04%和45.83%。
　　對獲得的轉基因植株進行Southern和Northern雜交

11、分析，結果表明，外源基因以不同的拷貝數(shù)整合到了水稻基因組中。在轉基因植株中靶病毒 RNA的下調是由初級的amiRNA介導所誘發(fā)的，并且沉默可以通過siRNA途徑向雙邊延長，初級的amiRNA和次級的siRNA共同介導轉基因植株對病毒的抗性。遺傳穩(wěn)定性分析表明轉基因和其介導的病毒抗性能在轉基因植株中穩(wěn)定遺傳。
　　（2）介體傳毒相關蛋白的鑒定及干擾基因的表達對介體傳毒的影響
　　以已報道的灰飛虱體內與RSV互作的蛋白基因NCu

12、P作為候選基因，設計引物，利用RT-PCR克隆得到目的基因。利用qRT-PCR技術，研究灰飛虱NCuP在介體的不同發(fā)育階段的表達特性，發(fā)現(xiàn)其在灰飛虱的整個發(fā)育過程中均有表達，但不同發(fā)育時期的表達是存在差異的，1齡若蟲的NCuP表達量最高，隨著昆蟲的生長其表達量逐漸降低。qRT-PCR檢測RSV的侵染對不同齡期灰飛虱NCuP表達的影響，結果顯示，帶毒灰飛虱體內的NCuP的表達水平明顯高于無毒灰飛虱體內的NCuP的表達水平，初步表明NCuP

13、可能參與了RSV在介體內的繁殖傳播。
　　體外合成NCuP的dsRNA，飼喂帶RSV的灰飛虱，利用qRT-PCR檢測靶基因及病毒基因在昆蟲體內的表達情況，結果顯示，飼喂dsNCuP的灰飛虱體內NCuP的表達水平和RSV的積累水平均有顯著降低，推測NCuP可能參與了RSV在介體內的繁殖。對飼喂dsNCuP的灰飛虱進行獲毒率和傳毒率的檢測發(fā)現(xiàn)，對照組的獲毒率和傳毒率分別為41.44%和68.33%，而飼喂 dsNCuP的灰飛虱的獲毒率