水稻黑條矮縮病毒編碼蛋白P7-2與寄住水稻蛋白互作研究.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus,RBSDV)是斐濟(jì)病毒屬的成員之一,可侵染玉米和水稻,引發(fā)玉米粗縮病和水稻黑條矮縮病,給亞洲水稻和玉米生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的損失。RBSDV的傳播介體為灰飛虱(Laodelphgaxstriatellus),且該病毒在寄主植物和昆蟲體內(nèi)均可復(fù)制。寄主植物感病后主要癥狀為植株矮化、葉脈上出現(xiàn)腫瘤狀突起等。RBSDV粒子呈正二十面體結(jié)構(gòu),具有雙層衣殼,衣殼內(nèi)部包含10條ds

2、RNA基因組(S1~S10),可編碼至少10個(gè)蛋白,并根據(jù)它們各自的基因片段命名。其中6個(gè)蛋白是病毒顆粒的結(jié)構(gòu)成分(P1,P2,P3,P4,P8,P10),6個(gè)為非結(jié)構(gòu)蛋白(P5,P6,P7-1,P7-2,P9-1,P9-2)。在非結(jié)構(gòu)蛋白中,P7-1被認(rèn)為可在昆蟲介體細(xì)胞中參與形成管狀結(jié)構(gòu),從而作為病毒胞間運(yùn)動(dòng)的通道。S9第一個(gè)ORF也編碼一個(gè)重要的非結(jié)構(gòu)蛋白P9-1,此蛋白在病毒侵染的植物或昆蟲細(xì)胞中形成復(fù)制場(chǎng)所(毒質(zhì)),是病毒復(fù)制

3、所必需的。另外,S5編碼的P5和S6編碼的P6蛋白也為非結(jié)構(gòu)蛋白,最近的研究表明這兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白與毒質(zhì)的生物學(xué)活性相關(guān)。目前對(duì)P7-2的了解較少,其功能尚不明確。
　　本研究采用分子克隆技術(shù),首先從感染RBSDV浙江分離物的水稻葉片中擴(kuò)增得到該病毒P7-2基因片段。將該基因亞克隆到原核表達(dá)載體pMAL-C2x中,將獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pMAL-P7-2在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。以純化的融合蛋白MBP-P7-

4、2為誘餌蛋白,通過Pull-Down實(shí)驗(yàn)在非變性條件下釣出感病水稻葉片總蛋白中的捕獲蛋白。Pull-Down后的樣品以空載體表達(dá)的標(biāo)簽蛋白MBP為陰性對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE,檢測(cè)到4個(gè)蛋白與目的蛋白特異結(jié)合,并進(jìn)一步通過串聯(lián)飛行質(zhì)譜分析鑒定這些捕獲蛋白。根據(jù)它們?cè)赗iceGenomeAnnotationProject中的序列比對(duì)分析,明確其中2個(gè)蛋白為轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白,1個(gè)蛋白為氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白,1個(gè)蛋白為假定的分子伴侶60的前體。實(shí)時(shí)熒光

5、定量PCR的數(shù)據(jù)分析表明,4個(gè)目的蛋白在感病水稻中的表達(dá)量與健康水稻中的表達(dá)量相比,轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白和假定的分子伴侶60的前體的表達(dá)量增加,氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白的表達(dá)量降低。據(jù)此推測(cè)RBSDVP7-2蛋白可能具有轉(zhuǎn)錄激活活性,并且抑制寄主中氨基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá),從而降低了寄主植物的抗病性。
　　此外,我們應(yīng)用了細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系對(duì)P7-2在植物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。將P7-2與eGFP的融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中進(jìn)行表達(dá)。通過共聚焦顯