南方水稻黑條矮縮病毒SRBSDV運(yùn)動(dòng)蛋白的鑒定及功能分析.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的水稻黑條矮縮病嚴(yán)重影響我國(guó)南方水稻種植區(qū)和玉米種植區(qū)的生產(chǎn)。目前，已完成SRBSDV的全基因組測(cè)序，明確了SRBSDV生物學(xué)和分子生物學(xué)特性，初步解析了病毒的基因組結(jié)構(gòu)和少數(shù)編碼蛋白的功能。但對(duì)于病毒編碼的多數(shù)蛋白的功能以及病毒的致病機(jī)制尚不清楚，特別是SRBSDV在植物細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制亟待研究。因此，本課題擬

2、克隆SRBSDV安徽分離物編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的4個(gè)基因，經(jīng)系列分子鑒定，明確SRBSDV編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白（MP），并深入探究MP的作用機(jī)制。
　　1 SRBSDV mp基因的鑒定
　　克隆SRBSDV S5-2、S7-1、S7-2和S9-24個(gè)基因，分別插入pCAM2300，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCAM-S5-2-GFP、pCAM-S7-1-GFP、pCAM-S7-2-GFP和pCAM-S9-2-GFP。分別插入pBin438，構(gòu)建重

3、組表達(dá)載體pBin-S5-2、pBin-S7-1、pBin-S7-2和pBin-S9-2。
　　（1）MP蛋白在煙草表皮細(xì)胞中的定位 pCAM-S5-2-GFP、pCAM-S7-1-GF P、pCAM-S7-2-GFP和pCAM-S9-2-GFP分別浸潤(rùn)本氏煙（Nicotiana benthamiana）葉片。未質(zhì)壁分離的細(xì)胞，熒光在細(xì)胞壁均勻分布；發(fā)生質(zhì)壁分離的細(xì)胞， pCAM-S7-1-GFP產(chǎn)生的熒光在細(xì)胞壁上呈不連續(xù)點(diǎn)狀分

4、布，其他3個(gè)處理的熒光不定位于細(xì)胞壁上或在細(xì)胞壁上不呈點(diǎn)狀分布。
　?。?）MP蛋白在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)含有pCAM-S5-2-GFP、pCAM-S7-1-GFP、pCAM-S7-2-GFP和pCAM-S9-2-GFP的農(nóng)桿菌稀釋后分別浸潤(rùn)本氏煙葉片， pCAM-S7-1-GFP能在本氏煙細(xì)胞間自主運(yùn)動(dòng)并擴(kuò)散到周?chē)徑?xì)胞，而pCAM-S5-2-GFP、pCAM-S7-2-GFP和pCAM-S9-2-GFP均定位于單個(gè)細(xì)胞，不能向鄰近細(xì)

5、胞擴(kuò)散。
　　（3） MP蛋白與PVX(△P25)-GFP的功能互補(bǔ) pBin-S5-2、pBin-S7-1、pBin-S7-2和pBin-S9-2分別與運(yùn)動(dòng)缺陷型載體PVX(△P25)-GFP共浸潤(rùn)本氏煙葉片。pBin-S7-1能夠互補(bǔ)PVX(△P25)-GFP在本氏煙細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)，而pBin-S5-2、pBin-S7-2和pBin-S9-2均不能互補(bǔ)PVX(△P25)-GFP在本氏煙細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)。
　　因此，鑒定S7-1

6、可能編碼SRBSDV的MP蛋白。
　　2 SRBSDV S7-1表達(dá)蛋白的自身互作及其與CP蛋白的互作
　　克隆SRBSDV S7-1和S10基因，分別插入pCV-cYFP和pCV-nYFP構(gòu)建重組表達(dá)載體pCV-S7-1-cYFP、pCV-S7-1-nYFP、pCV-S10-cYFP和pCV-S10-nYFP。分別插入pGADT7和pGBKT7構(gòu)建重組表達(dá)載體pGAD-S7-1、pGBK-S7-1、pGAD-S10和pGB

7、K-S10。
　?。?）雙分子熒光互補(bǔ)（BIFC）驗(yàn)證SRBSDV S7-1表達(dá)蛋白的自身互作及其與CP蛋白的互作 pCV-S7-1-nYFP與pCV-S7-1-cYFP、pCV-S7-1-nYFP與pCV-S10-cYFP及pCV-S7-1-cYFP與pCV-S10-nYFP分別共浸潤(rùn)本氏煙。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， SRBSDV S7-1表達(dá)的蛋白能自身互作，有明顯的黃色熒光出現(xiàn)，而與CP蛋白不能互作，無(wú)黃色熒光。
　?。?）酵母雙雜

8、交（Y2H）驗(yàn)證SRBSDV S7-1表達(dá)蛋白的自身互作及其與CP蛋白的互作 pGAD-S7-1與pGBK-S7-1、pGBK-S7-1與pGAD-S10及pGAD-S7-1與pGBK-S10分別共轉(zhuǎn)化酵母，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅pGAD-S7-1與pGBK-S7-1共轉(zhuǎn)化酵母能長(zhǎng)出白色酵母菌落，說(shuō)明SRBSDV S7-1表達(dá)蛋白能夠自身互作，而與CP蛋白不能互作。
　　3 SRBSDV S7-1基因的原核表達(dá)和純化
　　克隆SRBS