水稻抗黑條矮縮病相關(guān)miRNA鑒定及功能分析.pdf

1、水稻黑條矮縮病(RBSDV)是近年來我國(guó)華東稻區(qū)最為嚴(yán)重的水稻病毒病害，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量的提高。利用植物自身抗性培育抗性品種是防治該病毒病的根本策略。RNA沉默機(jī)制是植物抵御病毒侵染的重要途徑，miRNA是其中關(guān)鍵性的負(fù)調(diào)控因子，廣泛調(diào)控植物基因表達(dá)，生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等各個(gè)生物途徑。本研究在篩選出的抗感RBSDV水稻品種的基礎(chǔ)上構(gòu)建小RNA文庫(kù)，并通過高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析獲取在抗病和感病品種中脅迫相關(guān)水稻miRNA，并通過對(duì)

2、靶基因的預(yù)測(cè)和功能分析闡述miRNA在水稻接種病毒后對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育以及抗病相關(guān)途徑的影響。
　　本研究通過人工接種鑒定方法鑒定90個(gè)水稻品種得到了相對(duì)抗病品種9311和感病品種日本晴，并以此為材料構(gòu)建侵染前后抗感品種的莖稈及葉片小RNA文庫(kù)共8個(gè)。利用高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析篩選得到很多與水稻黑條矮縮病脅迫相關(guān)miRNA，結(jié)合Northem雜交、熒光定量等方法對(duì)部分miRNA及其靶基因進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)分析，得到主要結(jié)果如下:

3、>　　1.8個(gè)文庫(kù)獲得的小RNA序列總數(shù)在4795833～5697879之間，其中與水稻基因組匹配數(shù)在30.48％-45.97％之間。水稻黑條矮縮病脅迫后，樣本間miRNA差異表達(dá)莖稈和葉片全部下調(diào)的數(shù)目為38個(gè)，全部上調(diào)的數(shù)目為12個(gè);9311上調(diào)Nip下調(diào)的數(shù)目為31個(gè)，9311下調(diào)Nip上調(diào)的數(shù)目為1個(gè)，葉片上調(diào)莖稈下調(diào)的數(shù)目為9個(gè)，葉片下調(diào)莖稈上調(diào)的數(shù)目為18個(gè)。
　　2.在表達(dá)顯著的miRNA中挑出14個(gè)差異表達(dá)顯著的m

4、iRNA，這些miRNA分別隸屬于14個(gè)miRNA家族。通過Northern雜交驗(yàn)證試驗(yàn)，得到miR156和miR168的雜交條帶，其中9311葉片在脅迫后miR156的表達(dá)量明顯增加，莖稈在脅迫后miR156的表達(dá)量增加，日本晴葉片在脅迫后miR156的表達(dá)量明顯減少，莖稈在脅迫后miR156的表達(dá)量增加。而miR168在脅迫后葉片和莖稈表達(dá)量沒有發(fā)生明顯變化。
　　3.對(duì)14個(gè)表達(dá)豐度高的miRNA中的13個(gè)miRNA所預(yù)測(cè)到

5、的18個(gè)靶基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果挑選了9個(gè)表達(dá)水平大致與對(duì)應(yīng)miRNA呈現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的負(fù)調(diào)控變化的靶基因。對(duì)這些miRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR166d、miR444通過泛素途徑參與了蛋白質(zhì)的修飾、降解和積累過程;miR164通過調(diào)控靶基因（轉(zhuǎn)錄因子）影響生長(zhǎng)素梯度、側(cè)根的起始以及花瓣的數(shù)量;miR396d、miR160通過生長(zhǎng)素響應(yīng)途徑參與植物組織的生長(zhǎng)與發(fā)育;miR171、miR172通過調(diào)控靶基因（轉(zhuǎn)錄因子）影響蛋白質(zhì)的修飾、

6、降解和積累等過程。
　　4.對(duì)靶基因進(jìn)行5'RACE驗(yàn)證，驗(yàn)證出miR396d靶基因OS06g-02560的剪切位點(diǎn)，和miR444b靶基因OS02g-36924的剪切位點(diǎn)。
　　本研究通過對(duì)RBSDV脅迫后miRNA的分離、鑒定、表達(dá)分析得到了一批在抗感水稻品種中差異表達(dá)的水稻miRNA，發(fā)現(xiàn)這些miRNA參與到水稻組織生長(zhǎng)和發(fā)育途徑，這是首次報(bào)道與抗RBSDV相關(guān)的miRNA，為后續(xù)對(duì)植物抗病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和抗病品種的遺傳改