水稻抗逆相關(guān)基因與miRNA的分子進(jìn)化及OsCORA基因的抗寒功能分析.pdf

1、水稻（Oryza sativa L）是中國(guó)最重要的禾谷類(lèi)作物之一，然而，低溫、干旱等環(huán)境脅迫日益嚴(yán)重地威脅到我國(guó)的水稻生產(chǎn)。因此，深入開(kāi)展水稻抗逆相關(guān)基因的功能和進(jìn)化研究，對(duì)水稻安全生產(chǎn)意義重大。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，以及水稻(Oryza sativa)基因組測(cè)序的完成，水稻已經(jīng)成為一個(gè)重要的模式生物，在闡明植物發(fā)育和進(jìn)化上起到了極其重要的作用。特別是，越來(lái)越多的研究已經(jīng)揭示了水稻基因在抵抗逆境中的功能和作用機(jī)制。水稻基因組和豐

2、富的表達(dá)數(shù)據(jù)的可獲得，為深入研究水稻抗逆相關(guān)基因的功能和進(jìn)化提供了重要的基礎(chǔ)。因此，本論文在構(gòu)建植物抗逆基因數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，對(duì)水稻抗逆相關(guān)蛋白編碼基因和microRNA（miRNA）的分子進(jìn)化進(jìn)行了系統(tǒng)深入的分析，并對(duì)預(yù)測(cè)的水稻抗寒基因OsCORA和OsCAP進(jìn)行了基因克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與抗寒功能分析。論文研究取得以下主要結(jié)果:
　　1.本論文首先通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)檢索共獲得308個(gè)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的植物抗性相關(guān)的基因，共涉及了51個(gè)植物物種

3、;功能注釋分析顯示308個(gè)植物抗逆基因涉及1428個(gè)GO分類(lèi);將308個(gè)植物抗逆基因映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)他們共參與了203個(gè)調(diào)控通路，其中參與代謝通路的基因最多;最后基于以上分析結(jié)果構(gòu)建了植物抗逆基因數(shù)據(jù)庫(kù)(PlantTolerance Gene Database，網(wǎng)址為:http://rich.yunda.org/test/rg01/index.php)。
　　2.在上述構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)中，我們獲得了22個(gè)水稻抗逆相關(guān)基因。

4、利用生物信息學(xué)方法，對(duì)水稻抗逆相關(guān)基因的進(jìn)化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，水稻抗逆基因在低等植物中已經(jīng)存在，隨著植物的不斷進(jìn)化和生存環(huán)境的變化，水稻抗逆相關(guān)基因數(shù)量也隨之增加。在植物中，具有相似功能的基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)和motif結(jié)構(gòu)。特別是，在GSK1、RAN2抗逆基因中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)特有的motif結(jié)構(gòu)。GSK1特有的P-rich motif, RAN2特有的G-rich motif, RAN2特有的E-rich motif。這些保守的mo

5、tif結(jié)構(gòu)與基因的抗逆功能是密切相關(guān)的。進(jìn)化速率分析揭示，在進(jìn)化過(guò)程中，植物抗逆性相關(guān)基因受到較強(qiáng)的純化選擇作用，但是，仍然有50％的抗逆性相關(guān)基因存在正選擇位點(diǎn)，正選擇位點(diǎn)的存在為基因適應(yīng)外界環(huán)境變化提供了重要的基礎(chǔ)。
　　3.利用生物信息學(xué)的方法系統(tǒng)地分析了水稻中非生物脅迫相關(guān)的177個(gè)miRNA，這些miRNA上游啟動(dòng)子區(qū)主要包含TATA-box和脅迫相關(guān)的調(diào)控元件;許多脅迫相關(guān)的miRNA家族是水稻特異的，一些miRNA是

6、來(lái)源于基因組重復(fù);177個(gè)miRNA能夠預(yù)測(cè)靶向553個(gè)水稻基因，共預(yù)測(cè)到1562個(gè)靶位子，其中89.50％的靶位子有切割活力，10.50％靶位子有翻譯抑制活力。
　　4.對(duì)預(yù)測(cè)的兩個(gè)水稻抗寒基因OsCORA和OsCAP進(jìn)行了基因克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與功能驗(yàn)證?？寺y(cè)序得到OsCORA基因的cDNA序列長(zhǎng)度為885bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?73bp，編碼290aa，理論分子量為69kDa，等電點(diǎn)(PI)為5.04。OsCAP基因的cDNA

7、序列長(zhǎng)度為645bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?33bp，編碼210aa，理論分子量為53kDa，等電點(diǎn)(PI)為5.11。進(jìn)一步構(gòu)建了pBI121-OsCORA和pBI121-OsCAP重組質(zhì)粒，并對(duì)pBI121-OsCORA重組質(zhì)粒進(jìn)行了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。同時(shí)我們也構(gòu)建pET-28a-OsCORA重組質(zhì)粒，對(duì)pET-28a-OsCORA重組質(zhì)粒的抗寒功能進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示在高溫和低溫處理后，表達(dá)OsCORA蛋白的大腸桿菌的存活率顯著增強(qiáng)。