南方水稻黑條矮縮病毒基因序列特征及基質(zhì)蛋白與病毒防控藥劑相互作用研究.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)第二組一個(gè)新成員。南方水稻黑條矮縮病毒引起的新水稻矮縮病近年在越南北部和我國(guó)南方各省爆發(fā)，給我國(guó)水稻生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。尋找用于防控SRBSDV藥劑篩選的候選靶標(biāo)，建立基于SRBSDV靶標(biāo)蛋白的SRBSDV防控藥劑篩選模型，篩選出具有更高活性的抗SRBS

2、DV小分子化合物可為防治SRBSDV提供新的技術(shù)措施。本研究首先采用熒光定量PCR方法，對(duì)南方水稻黑條矮縮病毒的13個(gè)基因在水稻寄主中的豐度趨勢(shì)進(jìn)行考察，了解SRBSDV的基因組組成。選取表達(dá)量較高的S9、S8以及S10三個(gè)基因?yàn)楹蜻x靶標(biāo)，利用生物信息學(xué)研究了不同分離物基因組序列性質(zhì)，最終確定豐度最高且保守性最強(qiáng)的SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白為研究靶標(biāo)。結(jié)合生物信息學(xué)分析P9-1蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了其氮端保守區(qū)、碳端保守區(qū)和131

3、~160 aa的高變區(qū)。繼而純化獲得了野生型(WT-His-P9-1)、碳端截短23個(gè)氨基酸(TR-ΔC23-His-P9-1)，氮端截短6個(gè)氨基酸(TR-ΔN6-His-P9-1)以及138位定點(diǎn)突變型(MU-138-His-P9-1)的SRBSDV-P9-1靶標(biāo)蛋白。采用熒光滴定光譜法(fluorescence titration, FT)和微量熱泳動(dòng)技術(shù)(microscale thermophoresis, MST)，在離體條件下

4、探究了毒氟磷(dufulin,DFL)與四種蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)DFL與P9-1的結(jié)合常數(shù)為微摩爾級(jí)。同時(shí)，進(jìn)行DFL抑制SRBSDV的作用機(jī)制研究，即通過與SRBSDV-P9-1的碳端23個(gè)氨基酸結(jié)合，抑制病毒基質(zhì)的形成。建立了基于SRBSDV-P9-1靶標(biāo)蛋白來篩選新型病毒防控藥劑的作用模型。最后，基于建立的SRBSDV-P9-1靶標(biāo)蛋白作用模型，進(jìn)行DFL系列衍生物與蛋白的相互作用研究，篩選出結(jié)合作用更強(qiáng)的小分子化合物。具體結(jié)論如

5、下：
　　(1)SRBSDV基因在水稻體內(nèi)表達(dá)量分析
　　選取不同生長(zhǎng)期、不同地區(qū)、不同品種及感染病毒狀況的SRBSDV水稻作為研究對(duì)象，采用熒光定量PCR法，對(duì)SRBSDV的13個(gè)基因片段的表達(dá)量進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明：S9-1、S7-1基因呈現(xiàn)高表達(dá)量特性及S6基因呈現(xiàn)最低表達(dá)量特性，均不受寄主生長(zhǎng)期、地域、品種及病毒侵染狀態(tài)的影響；S8、S2基因呈現(xiàn)稍高的表達(dá)量；而其他基因片段如，S1、S3、S4、S5-1、S5-2、

6、S7-2、S9-2及S10則呈現(xiàn)不規(guī)律的表達(dá)趨勢(shì)。
　　(2)SRBSDV重要功能基因的生物信息學(xué)分析
　　利用分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析基因組核苷酸及氨基酸序列特征，明確不同分離物核苷酸序列的分類地位。對(duì)病毒基質(zhì)蛋白P9-1、外殼蛋白P10和核心蛋白P8進(jìn)行理化性質(zhì)和功能預(yù)測(cè)等分析，確認(rèn)各基因組的核苷酸全長(zhǎng)、GC含量、親水區(qū)及疏水區(qū)、編碼蛋白的信號(hào)肽、二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)等特征；利用Motif、Blast比對(duì)，對(duì)S8、S

7、9、S10序列進(jìn)行同源性分析；結(jié)合SNP對(duì)S8、S9、S10的核苷酸序列進(jìn)行突變分析，并結(jié)合建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步探索病毒的遺傳進(jìn)化趨勢(shì)。
　　(3) SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及高變結(jié)構(gòu)域分析
　　選擇S9基因組為研究對(duì)象，利用GeneDoc軟件分析SRBSDV及水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus, RBSDV)P9-1序列的保守結(jié)構(gòu)域及高變結(jié)構(gòu)域，研究表明：

8、SRBSDV-P9-1與RBSDV-P9-1序列的碳端和氮端具有高度的保守性；同時(shí)SRBSDV-P9-1與RBSDV-P9-1序列之間存在一個(gè)高變區(qū)，即131~160 aa。
　　(4)野生型和突變型SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白的表達(dá)與純化
　　基于SRBSDV-P9-1生物信息學(xué)研究結(jié)果，利用E. coli BL21(DE3) RIL表達(dá)菌株，成功表達(dá)和純化了野生型(WT-His-P9-1)及三種突變型基質(zhì)蛋白(TR-Δ

9、C23-His-P9-1、TR-ΔN6-His-P9-1以及MU-138-His-P9-1)。
　　(5)DFL及寧南霉素(ningnanmycin,NNM)與P9-1基質(zhì)蛋白相互作用研究
　　利用FT和MST技術(shù)研究了小分子化合物DFL、NNM與P9-1基質(zhì)蛋白的相互作用。研究結(jié)果表明：DFL與 WT-His-P9-1的結(jié)合力為1×105.061 M?1(FT)、3.26+/-0.46μM(MST)，NNM與WT-His-

10、P9-1的結(jié)合力為1×104.244 M?1(FT)、48.40+/-6.04μM(MST)，即DFL與P9-1基質(zhì)蛋白的結(jié)合力明顯強(qiáng)于NNM。為了探究DFL與P9-1的結(jié)合位點(diǎn)，利用FT和MST技術(shù)研究了DFL與TR-ΔC23-His-P9-1、TR-ΔN6-His-P9-1和MU-138-His-P9-1三種突變蛋白之間的結(jié)合作用力。研究結(jié)果表明：碳端23個(gè)氨基酸對(duì)于DFL與基質(zhì)蛋白的結(jié)合起到關(guān)鍵作用。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了基于 WT-

11、His-P9-1、TR-ΔC23-His-P9-1蛋白的防控 SRBSDV活性小分子化合物作用模型。
　　(6)基于SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白靶標(biāo)模型的DFL衍生物的篩選
　　基于構(gòu)建的靶標(biāo)蛋白作用模型，采用FT和MST技術(shù)手段，考察了DFL衍生物與WT-His-P9-1基質(zhì)蛋白的結(jié)合作用力。研究結(jié)果表明，芳雜環(huán)噻吩取代的化合物及苯環(huán)上沒有取代基、苯環(huán)引入?F、?Cl、?NO2、?CF3等六個(gè)DFL衍生物與WT-His-