蛋白酶激活受體4在肥大細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感性疼痛的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　蛋白酶激活受體4(protease-activated receptors4，PAR4)為G蛋白偶聯(lián)受體，參與多種病理生理的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶活化受體4(PAR4)具有抑制內(nèi)臟痛和內(nèi)臟高敏感作用。由于PAR4通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用，應(yīng)該能夠找到其在內(nèi)臟痛覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的下游效應(yīng)細(xì)胞。最近研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞(mast cells，MC)在腸易激綜合癥(IBS)內(nèi)臟高敏感的發(fā)生與肥大細(xì)胞活化以及PAR4表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，

2、推測(cè)肥大細(xì)胞可能是PAR4參與內(nèi)臟鎮(zhèn)痛的下游效應(yīng)靶點(diǎn)，PAR4可能通過(guò)作用于肥大細(xì)胞介導(dǎo)內(nèi)臟痛覺信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而其內(nèi)臟鎮(zhèn)痛作用是否直接與肥大細(xì)胞活化還不清楚。本研究以內(nèi)臟高敏感大鼠為研究模型，觀察PAR4活化對(duì)腸肥大細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)作用；以探討PAR4活化對(duì)胃腸道內(nèi)臟高敏感誘發(fā)的痛覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，從而為IBS病人內(nèi)臟高敏感性疼痛的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　材料與方法：
　　1、采用結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal dist

3、ension,CRD)的方法建立IBS內(nèi)臟高敏感動(dòng)物模型，并通過(guò)腹部撤回反射（abdominal withdrawal reflex,AWR）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行半定量評(píng)分、篩選建立模型成功的動(dòng)物。對(duì)達(dá)標(biāo)模型利用BL420-F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行肌電圖(electromyography,EMG)檢測(cè)。
　　2、IBS模型給予PAR4激動(dòng)劑(AYPGKF-NH2,PAR4-AP)(100μM，200μl)直腸內(nèi)注射，并通過(guò)AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，

4、進(jìn)行半定量評(píng)分。利用BL420-F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)再次進(jìn)行EMG檢測(cè)。
　　3、應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合甲苯胺藍(lán)染色技術(shù)觀察正常大鼠、IBS大鼠模型和IBS大鼠模型結(jié)腸內(nèi)注射PAR4-AP后觀察大鼠結(jié)腸和盲腸內(nèi)PAR4活化對(duì)NOS和P2X7在肥大細(xì)胞的表達(dá)的影響，比較正常組、IBS組、PAR4-AP組之間的表達(dá)差異。
　　4、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察PAR4、NOS、P2X7和類胰蛋白酶(Tryptase

5、，AA4)在大鼠結(jié)腸和盲腸組織內(nèi)和肥大細(xì)胞或肓腸組織內(nèi)的共表達(dá)，觀察PAR4活化對(duì)NOS、P2X7陽(yáng)性標(biāo)記肥大細(xì)胞的影響。
　　5、急性分離SD大鼠雙側(cè)股骨，骨髓干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法培養(yǎng)骨髓源性肥大細(xì)胞(bone-marrow-derived mast cell,BMMC)。PAR4-AP孵育培養(yǎng)的肥大細(xì)胞24h，流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察PAR4活化對(duì)肥大細(xì)胞表達(dá)PAR4、NOS和P2X7的影響。
　　6、大鼠I

6、BS模型直腸內(nèi)注射PAR4-AP，TRIZOL提取正常組、IBS組、PAR4-AP組直腸、結(jié)腸和盲腸組織的總RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PAR4活化對(duì)IL-1的基因表達(dá)變化的影響。
　　7、大鼠IBS模型直腸內(nèi)注射PAR4-AP，RIPA細(xì)胞裂解液提取正常組、IBS組、PAR4-AP組直腸、結(jié)腸和盲腸組織的總蛋白，Western blot法檢測(cè)NOS、P2X7和PAR4的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、PAR4活

7、化對(duì)IBS大鼠內(nèi)臟高敏感性疼痛的作用
　　（1）直結(jié)腸擴(kuò)張后AWR評(píng)分。與正常組相比，IBS組SD大鼠的AWR評(píng)分升高，內(nèi)臟疼痛敏感性升高；PAR4激動(dòng)組的AWR評(píng)分較IBS組降低，說(shuō)明PAR4激動(dòng)劑可以降低內(nèi)臟高敏感性。
　　（2）腹直肌肌電檢測(cè)。結(jié)果顯示大鼠IBS模型直腸內(nèi)注射PAR4-AP能明顯降低直腸擴(kuò)張誘發(fā)的肌電圖和平均峰值的曲線面積(area under the curve，AUC)。直腸擴(kuò)張?jiān)?0mmHg的壓力

8、下IBS組與PAR4激動(dòng)組之間有差異，IBS組與正常組之間有差異；在40mmHg的壓力下各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在60mmHg的壓力IBS組與PAR4激動(dòng)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、PAR4活化對(duì)IBS大鼠結(jié)腸和盲腸內(nèi)NOS和P2X7陽(yáng)性肥大細(xì)胞的影響
　?。?）PAR4陽(yáng)性細(xì)胞的變化。IBS組盲腸中PAR4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于正常組和PAR4激動(dòng)組；PAR4激動(dòng)組高于正常組。
　?。?）肥大細(xì)胞的變化。IBS組盲腸

9、中Tryptase陽(yáng)性肥大細(xì)胞數(shù)量明顯高于正常組和PAR4激動(dòng)組。
　?。?）NOS陽(yáng)性細(xì)胞的變化。IBS組盲腸中NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于正常組；PAR4激動(dòng)組高于正常組；PAR4激動(dòng)組與IBS組盲腸中NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)沒有明顯差異。
　　（4）P2X7陽(yáng)性細(xì)胞的變化。IBS組盲腸中P2X7陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于正常組和PAR4激動(dòng)組；PAR4激動(dòng)組高于正常組。
　　3、PAR4、NOS和P2X7在IBS大鼠腸粘膜或培養(yǎng)肥大細(xì)胞的表

10、達(dá)
　　免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡顯示在IBS大鼠模型腸粘膜或骨髓干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化法培養(yǎng)的肥大細(xì)胞表達(dá)PAR4、NOS和P2X7。可見AA4分別與PAR4、NOS和P2X7共存。
　　4、PAR4活化對(duì)肥大細(xì)胞的影響
　　（1）PAR4激動(dòng)劑對(duì)PAR4在肥大細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的影響。Western blotting和流式細(xì)胞技術(shù)顯示，PAR4激動(dòng)劑使培養(yǎng)的肥大細(xì)胞PAR4蛋白的表達(dá)明顯增加。
　?。?）PAR

11、4激動(dòng)劑對(duì)NOS在肥大細(xì)胞表達(dá)的影響。Western blotting和流式細(xì)胞技術(shù)顯示，PAR4激動(dòng)劑使使培養(yǎng)的肥大細(xì)胞NOS表達(dá)明顯增加。
　　5、PAR4活化下調(diào)IL-1βmRNA表達(dá)。
　　實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)顯示大鼠IBS模型直腸內(nèi)注射PAR4-AP能明顯降低IL-1βmRNA水平。IBS組IL-1β基因表達(dá)量明顯高于對(duì)照組正常組，PAR4-AP組大鼠腸組織中IL-1β基因表達(dá)量介于IBS組與正常對(duì)照組之間。