肥大細胞類胰蛋白酶對人腎成纖維細胞影響的實驗研究.pdf

1、目的:肥大細胞類胰蛋白酶已被證明在皮膚、肺成纖維細胞和肝星型細胞增生和膠原合成中具有重要作用.該實驗研究肥大細胞類胰蛋白酶(tryptase)及蛋白水解酶抑制劑苯甲脒(benzamidine hydrochloride hydrate,BZ)對人腎成纖維細胞的影響,以探討肥大細胞類胰蛋白酶在腎纖維化過程中的作用.方法:收集因腎腫瘤作腎切除術的人腎標本,取遠離腫瘤部位的腎組織(經光鏡檢查,無腫瘤細胞),分離、培養(yǎng)人腎間質成纖維細胞.應用細

2、胞形態(tài)學、免疫細胞化學和電鏡鑒定培養(yǎng)的細胞為人腎成纖維細胞后,分為以下各實驗組:1. 各濃度類胰蛋白酶加等量肝素(wt/wt):(1)0ng/ml類胰蛋白酶+0ng/ml肝素;(2)10ng/ml類胰蛋白酶+10ng/ml肝素;(3)100ng/ml類胰蛋白酶+100ng/ml肝素;(4)500ng/ml類胰蛋白酶+500ng/ml肝素.2. 不加肝素的各濃度類胰蛋白酶:(1)0ng/ml類胰蛋白酶;(2)10ng/ml類胰蛋白酶;(3

3、)100ng/ml類胰蛋白酶;(4)500ng/ml類胰蛋白酶.3.各濃度肝素單獨作用:(1)0ng/ml肝素;(2)10ng/ml肝素;(3)100ng/ml肝素;(4)500ng/ml肝素.4.200umol/L蛋白水解酶抑制劑苯甲脒(benzamidine hydrochloride hydrate,BZ)處理組:(1)10ng/ml類胰蛋白酶+10ng/ml肝素+200umol/L BZ;(2)100ng/ml類胰蛋白酶+100

4、ng/ml肝素+200umol/L BZ;(3)500ng/ml類胰蛋白酶+500ng/ml肝素+200umol/L BZ.5.10ug/ml TGF-β抗體處理組:(1)10ng/ml類胰蛋白酶+10ng/ml肝素+10ug/ml TGF-β抗體;(2)100ng/ml類胰蛋白酶+100ng/ml肝素+10ug/mlTGF-β抗體;(3)500ng/ml類胰蛋白酶+500ng/ml肝素+10ug/mlTGF-β抗體.各組細胞培養(yǎng)48h

5、后,檢測人腎成纖維細胞的增生狀態(tài),I型膠原、蛋白水解酶激活受體2(protease activated receptor-2, PAR2)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP1)以及α-平滑肌肌動蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表達.成纖維細胞的增生狀態(tài)采用四甲基偶氮唑鹽(Methylthio tetrazole, MTT)比色法檢測

6、.I型膠原、PAR2、MCP1mRNA的表達采用半定量反轉錄-多聚酶鏈式反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法檢測.Α-SMA蛋白表達采用免疫細胞化學方法檢測. 結果:1. 原代培養(yǎng)的人腎組織細胞,在倒置顯微鏡下呈梭型生長;免疫細胞化學染色顯示所培養(yǎng)細胞波形蛋白(vimentin)和α-SMA陽性,角蛋白(keratin)和CD34陰性;電鏡下可見細胞內有

7、大量微絲、高爾基復合體和粗面內質網,證明我們所培養(yǎng)的細胞是人腎成纖維細胞;2. 類胰蛋白酶在10~500ng/ml范圍內,以劑量依賴方式促進人腎成纖維細胞增生,最高達對照組的3.07倍.在200umol/L苯甲脒作用下,類胰蛋白酶的促培養(yǎng)細胞增生效應被抑制,最高可抑制81﹪;3. 半定量RT-PCR法擴增PAR2、I型膠原和MCP1mRNA(324bp、332bp、257bp)結果表明:在等量肝素存在條件下,類胰蛋白酶在10~500ng

8、/ml范圍內,以劑量依賴方式促進培養(yǎng)的人腎成纖維細胞表達I型膠原、PAR2和MCP1,最高分別達對照組的3.14、3.71、4.98倍.200umol/L苯甲脒能抑制類胰蛋白酶對培養(yǎng)的人成纖維細胞表達I型膠原、PAR2和MCP1的促進作用,抑制率為53﹪~84﹪.結論:1.該實驗成功培養(yǎng)了人腎成纖維細胞.2. 在肝素的協(xié)同作用下,類胰蛋白酶能刺激體外培養(yǎng)的人腎成纖維細胞增生、活化,表達PAR2和MCP1等致炎致纖維化因子,表達腎間質EC