丹參對(duì)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞體外增殖的影響.pdf

1、目的:本研究采用單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)患者腎臟手術(shù)取材標(biāo)本通過體外培養(yǎng)、鑒定人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞(human renal interstitial fibroblasts，hRIFs)并觀察中藥丹參的主要成分——丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinone Ⅱ-A sulfonate，DS-201)對(duì)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞體外增殖周期的影響以及P16、P27表達(dá)的影響，

2、從分子水平揭示丹參酮ⅡA磺酸鈉影響hRIFs體外增殖的作用機(jī)制，闡明其在延緩腎間質(zhì)纖維化過程中作用的具體環(huán)節(jié)，為中藥丹參治療腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.單側(cè)輸尿管梗阻(UU0)患者手術(shù)取材標(biāo)本，采用組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistery，ICC)技術(shù)和染色體核型分析對(duì)各代細(xì)

3、胞進(jìn)行鑒定。2.取第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hRIFs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。①采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和圖像分析技術(shù)檢測(cè)0mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml DS-201孵育hRIFs 72小時(shí)后P16、P27的表達(dá)，并檢測(cè)陽性率及陽性細(xì)胞平均光密度值；②流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)0mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml DS-201對(duì)hRIFs體外增殖周期的影響。結(jié)果:1.原代培養(yǎng)5～7天后，組織

4、塊周圍開始長(zhǎng)出細(xì)胞，以立方和長(zhǎng)梭形細(xì)胞為主，12～14天后細(xì)胞可以鋪滿瓶底；第2～5代細(xì)胞形態(tài)較為均一，多呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞呈柵欄狀、魚群狀排列，核橢圓形，可見1～2個(gè)核仁，胞漿豐富，細(xì)胞周圍可見長(zhǎng)短不一的細(xì)胞突起。第2代細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)波形蛋白(vimentin)強(qiáng)陽性，角蛋白(keratin)散在個(gè)別細(xì)胞陽性，第3～5代細(xì)胞除vimentin強(qiáng)陽性外，結(jié)蛋白(desmin)和keratin均呈陰性表達(dá)，顯示細(xì)胞經(jīng)多次傳代后已達(dá)到純化

5、的目的；對(duì)2～5代細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析鑒定，結(jié)果顯示體外培養(yǎng)第2～5代細(xì)胞具有正常人體二倍體細(xì)胞的核型，以上結(jié)果說明第3～5代細(xì)胞為純化的正常人體二倍體核型的成纖維細(xì)胞。2.①與對(duì)照組相比，各DS-201組hRIFs隨著用藥濃度的增高，細(xì)胞染色強(qiáng)度增強(qiáng)，細(xì)胞變得疏松，hRIFs形態(tài)變化較大，由均一的梭形變成橢圓形甚至圓形；各實(shí)驗(yàn)組陽性率及平均光密度值顯著增加，高于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組間，隨著DS-201濃度的增加，P16、P

6、27的表達(dá)均有顯著差異，平均光密度值顯著增加(P<0.05)。②在0～2.0mg/ml濃度范圍內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組隨DS-201濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比逐漸增多，而S期細(xì)胞比逐漸下降，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異均有顯著意義(P<0.05)。結(jié)論:1.體外成功培養(yǎng)hRIFs，第3～5代細(xì)胞可作為實(shí)驗(yàn)供體。2.DS-201對(duì)hRIFs體外增殖周期具有抑制作用，可能是其抑制RIF的機(jī)制之一。3.DS-201可能通過促進(jìn)G1期關(guān)鍵的細(xì)胞周期素依賴激