激活素A及卵泡抑素對大鼠腎間質成纖維細胞的影響.pdf

1、目的：觀察激活素A(ActivinA，ACT-A)及其抑制劑卵泡抑素(Follistain，F(xiàn)S)對大鼠腎間質成纖維細胞增殖、活化及產生細胞外基質(Extracellularmatrix，ECM)的影響，以探討ACT-A在腎間質纖維化發(fā)生機制中的作用。 方法：無菌條件下取體重100-120g雄性SD大鼠腎臟，剪除腎臟表面包膜及腎皮質，剪碎剩余的腎組織經酶消化法原代培養(yǎng)。應用細胞形態(tài)學、免疫細胞化學和電鏡技術，鑒定培養(yǎng)細胞為大鼠腎

2、間質成纖維細胞。實驗分為以下各組： (一)A組：各濃度ACT-A單獨作用 1.0ng/mlACT-A2.0.3ng/mlACT-A3.3ng/mlACT-A4.30ng/mlACT-A5.100ng/mlACT-A (二)F組：各濃度FS單獨作用 1.0ng/mlFS2.0.3ng/mlFS3.3ng/mlFS4.30ng/mlFS5.100ng/mlFS (三)A+F組：30ng/mlACT-A

3、+不同濃度FS聯(lián)合作用 1.30ng/mlACT-A+0ng/mlFS2.30ng/mlACT-A+0.3ng/mlFS3.30ng/mlACT-A+3ng/mlFS4.30ng/mlACT-A+30ng/mlFS5.30ng/mlACT-A+100ng/mlFS 給予各組細胞不同的刺激后，檢測大鼠腎間質成纖維細胞的增殖情況，Ⅰ型膠原(CollagenⅠ，ColⅠ)、Ⅳ型膠原(CollagenⅣ，ColⅣ)、羥脯氨酸(h

4、ydroxyproline，HYP)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、α-平滑肌肌動蛋白(Alpha-smoothmuscleactin，α-SMA)及轉化生長因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)的表達。腎間質成纖維細胞的增殖情況采用四甲基偶氮唑鹽(Methylthiotetrazole，MTT)比色法檢測。ColⅠ、TGF-β1、α-SMA、FNmRNA的表達采用半定量逆轉錄

5、-多聚酶鏈式反應(Reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)方法檢測。α-SMA、Ⅰ型膠原、TGF-β1表達采用免疫細胞化學方法檢測。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測培養(yǎng)液上清中FN、Ⅳ型膠原的含量。羥脯氨酸試劑盒測定培養(yǎng)液中HYP的含量。 結果： 1.原代培養(yǎng)的大鼠腎間質細胞，倒置顯微鏡下呈梭型生長；免疫細胞化學染色顯示培養(yǎng)細胞波形蛋白(vimentin)陽性，角蛋白(

6、keratin)陰性；電鏡下可見細胞內有大量微絲、高爾基復合體和粗面內質網，證明我們所培養(yǎng)的細胞是大鼠腎間質成纖維細胞。 2.MTT法測腎間質成纖維細胞的增殖情況，結果表明：ACT-A在0.3～30ng/ml范圍內，以劑量依賴方式促進大鼠腎間質成纖維細胞增殖；在所研究的劑量范圍內，30ng/mlACT-A促進大鼠腎間質成纖維細胞增殖的作用最強，當ACT-A濃度為100ng/ml時，刺激腎間質成纖維細胞增殖的作用反而減弱。單純加入

7、FS，在所觀察的濃度范圍內，對大鼠腎間質成纖維細胞增殖沒有影響，但FS以劑量依賴方式抑制ACT-A的促大鼠腎間質成纖維細胞增殖作用。 3.半定量RT-PCR法擴增FN、ColⅠ、TGF-β1、α-SMAmRNA(481bp、487bp、303bp、222bp)。結果表明：ACT-A在0.3～100ng/ml范圍內，以劑量依賴方式促進大鼠腎間質成纖維細胞表達ColⅠ、TGF-β1、α-SMAmRNA，而對FNmRNA的表達沒有明顯

8、影響。單純加入FS，在所觀察的濃度范圍內，對大鼠腎間質成纖維細胞表達ColⅠ、TGF-β1、α-SMA、FNmRNA的表達沒有明顯影響；但FS以劑量依賴方式抑制ACT-A的促大鼠腎間質成纖維細胞表達ColⅠ、TGF-β1、α-SMAmRNA的作用，對大鼠腎間質成纖維細胞表達FNmRNA沒有影響。 4.檢測培養(yǎng)液中FN和Ⅳ型膠原濃度以及HYP含量。結果表明：在0.3～100ng/ml范圍內，ACT-A濃度越高，培養(yǎng)液中Ⅳ型膠原濃度

9、和HYP含量也越高，呈劑量依賴關系；對FN濃度無明顯影響。在所觀察的濃度范圍內，單純加入FS對大鼠腎間質成纖維細胞分泌Ⅳ型膠原和FN濃度沒有影響，但以劑量依賴方式抑制ACT-A促大鼠腎間質成纖維細胞分泌Ⅳ型膠原及分泌HYP的作用。 結論： 1.本實驗成功培養(yǎng)了大鼠腎間質成纖維細胞。 2.ACT-A刺激體外培養(yǎng)的大鼠腎間質成纖維細胞增殖、活化，并使ECM產生增多，提示ACT-A是重要的致纖維化因子，可能參與了慢性腎