丹參酮ⅡA磺酸鈉對人腎間質(zhì)成纖維細胞體外增殖及CyclinD1、CyclinE表達的影響.pdf

1、目的：通過體外培養(yǎng)單側(cè)輸尿管梗阻(unilateralureteralobstruction，UUO)病人腎間質(zhì)成纖維細胞(humanRenalInterstitialfibroblasts，hRIFs)，觀察其增殖規(guī)律和中藥丹參主要成分丹參酮ⅡA的水溶性制劑—丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodiumtanshinoneⅡ-Asulfonate，DS-201)對hRIFs體外增殖及細胞周期素D1(CyclinD1)、細胞周期素E(CyclinE)

2、表達的影響，探討中藥丹參成分對腎間質(zhì)纖維化(Renalinterstitialfibrosis，RIF)的影響及其分子機制，為臨床使用中藥丹參治療RIF提供理論和實驗依據(jù)。 方法：1.單側(cè)輸尿管梗阻患者手術(shù)取材標本，采用組織塊法體外培養(yǎng)細胞。用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，并用免疫細胞化學(immunocytochemistry，ICC)和染色體核型分析方法對各代細胞進行鑒定。 2.取第3代對數(shù)生長期hRIFs用無血清16

3、40培養(yǎng)基制成6×104/ml細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細胞懸液量為100μl；培養(yǎng)18小時后更換培養(yǎng)基，開始實驗。各實驗組加入DS-201終濃度分別為0.5mg/ml、1.0mg/ml和2.0mg/ml含10％小牛血清(newbeefserum，NBS)的1640培養(yǎng)基200μl繼續(xù)培養(yǎng)；同一藥物濃度組設(shè)25個復孔，以不加藥組為對照。于實驗開始后的第1、3、5、7、9天每組各取5個復孔做MTT比色實驗，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長49

4、0nm處檢測吸光光度值(A)。按公式：抑制率(IR)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100％計算IR，并求其均值IRA。 3.ICC結(jié)合圖像分析技術(shù)檢測DS-201對hRIFs中PCNA表達的影響。 4.ICC結(jié)合圖像分析技術(shù)檢測①對照組hRIFs在培養(yǎng)第1、3、5、7、9天各個時間點的細胞總量、CyclinD1和CyclinE表達陽性的細胞數(shù)量，并按公式：陽性細胞比率=陽性細胞數(shù)量/細胞總量計算各時間點CyclinD

5、1和CyclinE的陽性細胞比率；②對照組與各實驗組hRIFs體外培養(yǎng)第1、3、5、7、9天CyclinD1和CyclinE表達陽性細胞的平均光密度值。 結(jié)果：1.原代培養(yǎng)5～7天后，組織塊周圍開始長出細胞，細胞形態(tài)以立方形和長梭形為主；大約2周后，占絕對優(yōu)勢的長梭形細胞可鋪滿瓶底。第2～5代細胞形態(tài)較為均一，多呈長梭形，胞漿豐富，1～2個核仁不等，細胞呈柵欄狀排列，周圍有長短不一的軸狀突起，并有無定形成分分布于四周；ICC檢測

6、第2代細胞表達波形蛋白(vimentin)強陽性，角蛋白(keratin)散在灶性個別細胞弱陽性；第3～5代細胞均表達vimentin強陽性，結(jié)蛋白(desmin)和keratin陰性；染色體核型分析結(jié)果顯示第2～5代細胞呈正常人體的二倍體核型表現(xiàn)。 2.同一濃度DS-201的IRA隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高；同一時間點，IRA隨用藥濃度的增加而升高。 3.體外培養(yǎng)第3、5、7、9天，各實驗組PCNA陽性細胞平均光密度值

7、相對于對照組顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，第1天各組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；同一時間點不同實驗組之間兩兩比較平均光密度值無顯著差異(P＞0.05)。 4.①體外培養(yǎng)1～9天，hRIFs細胞總量逐漸增加，生長曲線呈“S”形，第3～5天細胞數(shù)量增長最迅速，為對數(shù)生長期；CyclinD1、CyclinE表達陽性細胞的百分比在第5天最高，第3、5天CyclinD1、CyclinE陽性細胞平均光密度值顯著高于第1、7、

8、9天；②同一時間點各實驗組與對照組相比，隨用藥濃度的升高，細胞總量逐漸減少，CyclinD1、CyclinE陽性表達的細胞數(shù)量也相應(yīng)減少，細胞中陽性信號的顏色由棕黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色甚至呈陰性表達。用藥后hRIFs形態(tài)由均一的梭形變成圓形、橢圓形、細長不規(guī)則條狀等，且隨著藥物濃度的增大形態(tài)變化越明顯；CyclinD1、CyclinE陽性細胞平均光密度值的變化規(guī)律較一致：第5天達到高峰，第7～9天逐漸下降；在培養(yǎng)的第1天各實驗組與對照組比較，

9、CyclinD1、CyclinE陽性細胞的平均光密度值無顯著差異，在培養(yǎng)的第3、5、7、9天，DS-201組平均光密度值相對于對照組顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)；0.5mg/ml組CyclinD1陽性細胞平均光密度值3～5天逐漸增加(第3天1.2970±0.1052；第5天1.3814±0.5974)，而CyclinE平均光密度值下降(第3天1.3439±0.1263；第5天1.0873±0.3660)。 結(jié)論：1.體

10、外成功培養(yǎng)出hRIFs，第3～5代細胞可作為實驗供體。 2.DS-201對hRIFs體外增殖具有抑制作用，這種作用在培養(yǎng)的早期并不明顯，可能與培養(yǎng)早期細胞多數(shù)仍處在G0期，進入細胞增殖周期的數(shù)目較少有關(guān)。 3.CyclinD1、CyclinE表達與hRIFs體外增殖有關(guān)，可能在RIF形成過程中發(fā)揮重要作用；DS-201影響hRIFs增殖可能是通過直接抑制G1期關(guān)鍵的細胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE表達，阻滯細