丹參酮ⅡA磺酸鈉對培養(yǎng)人晚期腎臟病腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進展到終末期的共同形態(tài)學(xué)特點和結(jié)局。細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)的過度沉積是引起腎間質(zhì)纖維化的主要原因。腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞作為產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，其增殖與聚集則是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化病理變化的基礎(chǔ)。丹參是近年來臨床常用的抗纖維化藥物，但對小管間質(zhì)纖維化的具體作用機制仍不清楚。丹參酮ⅡA磺酸鈉是從中藥丹參中提取的重要活性成分之一，本研究以培養(yǎng)的人晚期腎臟病腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞為實驗?zāi)Ｐ?，探討丹參酮ⅡA磺酸鈉對其增殖、

2、凋亡及分泌膠原蛋白的影響，為腎臟疾病的臨床防治提供理論依據(jù)。 方法：1.將手術(shù)切除的梗阻性腎病患者的腎皮質(zhì)在無菌條件下進行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)基選用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基。細(xì)胞生長達聚合狀態(tài)時進行傳代，傳至第2、3、4代的細(xì)胞呈均勻一致的梭形、圓形細(xì)胞基本消失，且細(xì)胞角蛋白表達陰性、結(jié)蛋白表達陰性、波形蛋白表達陽性，確認(rèn)為成纖維細(xì)胞。本實驗選用第2～4代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進行試驗。 2.實驗分濃度組和作用時間組兩部分

3、，均設(shè)復(fù)孔，實驗重復(fù)兩次。將消化后的細(xì)胞用無血清的1640培養(yǎng)基按比例稀釋至1×105個/ml左右，以每孔2ml細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)種至24孔板內(nèi)的蓋玻片上。繼續(xù)培養(yǎng)24小時待細(xì)胞貼壁后，加藥組依次換含有丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度為0.5、1.0、2.0mg/ml的培養(yǎng)液2ml，對照組僅加入1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3天后，取出細(xì)胞爬片進行檢測。作用時間組則僅在孔板內(nèi)加入2ml含丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度為1.0mg/ml的培養(yǎng)液，對照組加2ml1640培養(yǎng)基

4、，每隔48小時換所用原液。在藥物作用后的第1、2、3、4、5天取出細(xì)胞爬片進行指標(biāo)檢測。 3.利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測在經(jīng)丹參酮ⅡA磺酸鈉干預(yù)后實驗組及對照組成纖維細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen，PCNA)、P27蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的表達情況，計算細(xì)胞的陽性表達率。同時用TUNEL法檢測成纖維細(xì)胞的凋亡指數(shù)(apoptoticindex，AI)。 4.實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±

5、標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及LSD法進行差異比較，取α=0.05為顯著性檢驗水準(zhǔn)。 結(jié)果：1.丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度為0.5、1.0、2.0mg/ml時，作用3天后PCNA的陽性表達率分別為74.67％±3.47％、56.01％±2.64％、37.01％±2.56％，均高于對照組82.00％±3.83％。各實驗組與對照組及各實驗組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨著丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度增加，PCNA陽性表達率減低。丹

6、參酮ⅡA磺酸鈉濃度為1.0mg/ml時，在作用第1、2、3、4、5天后，成纖維細(xì)胞PCNA的陽性表達率分別為71.87％±1.54％、68.59％±2.23％、56.01％±2.64％、48.37％±2.58％、35.67％±3.49％，實驗組第1天與對照組和實驗組第2天的PCNA陽性表達率相比無明顯差異(P＞0.05)。其余各實驗組與對照組及實驗組之間比較PCNA陽性表達率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000＜0.01)。表明丹參酮Ⅱ

7、A磺酸鈉作用后從第2天開始PCNA蛋白的陽性表達率隨著藥物作用時間的延長而遞減。 2.丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度為0.5、1.0、2.0mg/ml時，P27蛋白的陽性表達率分別為30.32％±1.57％、38.97％±1.05％、44.63％±1.56％，均高于對照組24.35％±0.83％。各實驗組與對照組及各實驗組之間比較P27蛋白的陽性表達率具有顯著性差異(P＜0.01)。隨著丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度增加，P27蛋白的陽性表達率增加

8、。丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度為1.0mg/ml時，依次作用1、2、3、4、5天后，成纖維細(xì)胞P27蛋白的陽性表達率分別為21.86％±1.24％、26.60％±2.04％、38.97％±1.05％、43.11％±1.18％、52.34％±2.13％，其中第1天實驗組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其余各實驗組與對照組及實驗組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明加入藥物后的第1天P27蛋白的陽性表達率無明顯變化，從第2天

9、開始，隨著藥物作用時間的延長，成纖維細(xì)胞P27蛋白的陽性表達率增高。 3.丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度為0.5、1.0、2.0mg/ml時，Ⅲ型膠原蛋白的陽性表達率分別為34.76％±2.08％、23.67％±1.43％、19.38％±1.79％，均低于對照組91.26％±1.25％。各實驗組與對照組及各實驗組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨著丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度增加，Ⅲ型膠原蛋白的陽性表達率逐漸降低。丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度為

10、1.0mg/ml時，作用1、2、3、4、5天后，成纖維細(xì)胞Ⅲ型膠原蛋白的陽性表達率分別為54.67％±2.08％、38.54％±1.00％、23.67％±1.43％、17.59％±3.04％、16.78％±1.15％，與對照組比較統(tǒng)計學(xué)差異具有顯著性(P=0.000＜0.01)，實驗組第4天和第5天比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其余各實驗組之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。從第1天至第4天隨著藥物作用時間的延長，成纖維

11、細(xì)胞Ⅲ型膠原蛋白的陽性表達率逐漸下降，至第5天抑制作用已不明顯。 4.丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度為0.5、1.0、2.0mg/ml時，成纖維細(xì)胞的凋亡指數(shù)分別為9.10％±2.78％、27.85％±2.95％、39.20％±3.16％，均高于對照組4.71％±0.66％。各實驗組與對照組及各實驗組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明丹參酮ⅡA磺酸鈉能夠促進成纖維細(xì)胞凋亡，且隨著丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度的增加，凋亡指數(shù)增加。丹參酮

12、ⅡA磺酸鈉濃度為1.0mg/ml時，作用1、2、3、4、5天后，成纖維細(xì)胞的凋亡指數(shù)分別為5.55％±0.78％、13.35％±1.67％、27.85％±2.95％、42.08％±1.12％、51.03％±2.34％，第1天實驗組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其余各時間組與對照組比較差異具有顯著性(P=0.000＜0.01)。丹參酮ⅡA磺酸鈉作用1天后凋亡指數(shù)增加不明顯，從第2天開始隨著藥物作用時間的延長，成纖維細(xì)胞凋亡

13、指數(shù)增加。 結(jié)論：丹參酮ⅡA磺酸鈉能抑制人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞表達PCNA和Ⅲ型膠原蛋白，促進P27蛋白的表達和細(xì)胞凋亡，具有量效關(guān)系。作用時間組中丹參酮ⅡA磺酸鈉作用1天后，PCNA、P27蛋白的陽性表達率和凋亡指數(shù)并無明顯改變，從第2天開始至第5天，隨著作用時間的延長PCNA的陽性表達率減低，P27蛋白的陽性表達率和凋亡指數(shù)升高。Ⅲ型膠原蛋白的陽性表達率在藥物作用后的第1天即有下降，至第4天隨著作用時間的延長，表達率遞減，在第5