靶向siRNA體外抑制大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MAS 基因表達(dá)的研究.pdf

1、 目的：探討體外直接轉(zhuǎn)染以大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞(NRK-49F) MAS基因?yàn)榘袠?biāo)的小干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)后, NRK-49F的MAS基因的mRNA表達(dá)和蛋白水平是否受到抑制,篩選出高效的siRNA,為進(jìn)一步研究MAS基因在腎臟疾病中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：(1)靶向MAS基因的siRNA的設(shè)計(jì)及合成：通過(guò)NCBI檢索大鼠MAS基因序列,按照siRNA序列設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并合成特異性沉默

2、MAS的siRNA3對(duì)：siRNA-1(5'-CCUGACCAGA GCUUUCAAATT-3',5'-UUUGAAAGCUCUGGUCAGGTT-3')、siR NA-2(5'- GACCAAUCAAAUAUGACAUTT - 3',5'- AUGUCAUA UUUGAUUGGUCTT-3')、siRNA-3(5'-GCCAUUACUACACAAUC GUTT-3',5'-ACGAUUGUGUAGUAAUGGCTT-3')；陰性對(duì)照s

3、iRNA (siRNA-neg)(5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3',5'-ACGU GACACGUUCGGAGAATT-3')1對(duì)。(2)細(xì)胞培養(yǎng)：NRK-49F細(xì)胞置于DMEM /F12培養(yǎng)基中(含有l(wèi)0%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素),在37℃、5%CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱中,用0.25%胰酶消化傳代,待細(xì)胞懸液內(nèi)的細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后,將細(xì)胞制成1×105/ml的細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

4、。(3)實(shí)驗(yàn)分組：①M(fèi)AS siRNA-1 ： 加 入 含 siRNA 序 列 1 的 轉(zhuǎn) 染 混 合 物(transfection complexes,TC)；②MAS siRNA-2：加入含siRNA序列2的TC；③MAS siRNA-3：加入含siRNA序列3的TC；④ 陰性對(duì)照組(CG)：加入含siRNA陰性序列的TC；⑤ 空白對(duì)照組(NG)：只加入轉(zhuǎn)染試劑；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。(4)轉(zhuǎn)染：將HiPerFect Transfecti

5、on Reagent 12ul與無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)液混合,配成100ul轉(zhuǎn)染液后,再加入終濃度為10nM的siRNA,兩者混勻常溫孵育5-10分鐘。將轉(zhuǎn)染混合物加入六孔板中,輕輕晃動(dòng)保證轉(zhuǎn)染混合物分布均勻,恒溫箱中孵育,48小時(shí)后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。(5)基因表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( rever-setranscription -polymerase chain reaction , RT-PCR)與蛋白質(zhì)印跡法(Western

6、blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后MAS的mRNA與蛋白表達(dá)的變化。(6)圖像處理：采用Quantity One 4.4.0軟件測(cè)定各組灰度值。(7)統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用軟件spss17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,通過(guò)單因素方差分析檢驗(yàn)各組間差異性,P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：經(jīng)siRNA干擾后,3條靶向siRNAs均能不同程度的抑制MAS基因的表達(dá)。RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示siRNA-1組、siRNA-2組及siRNA-3組NRK-49F細(xì)胞MAS

7、的mRNA水平與空白對(duì)照組相比顯著降低(P〈0.05) , 各組 MAS 與 GAPDH 灰度值的比值分別為0.5772±0.0220 , 0.3380±0.0434 , 0.6164±0.0767 ,抑制率分別達(dá)到26.89%,57.12%,21.73%,而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間mRNA的表達(dá)水平比較則無(wú)顯著下降。Western blot 方法檢測(cè)結(jié)果顯示：3條靶向MAS的特異性序列siRNA蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比顯著降低(