血管緊張素-(1-7)對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的影響.pdf

1、目的:觀察血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞(NRK-49F)活化及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響,并初步探討其機(jī)制。
　　 方法:
　　 實驗一:AngⅡ與Ang-(1-7)最佳作用濃度及作用時間確定。(1)確定AngⅡ引起NRK-49F細(xì)胞活化的最佳作用濃度及作用時間。體外傳代培養(yǎng)NRK-49F細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1X105／ml,接種于六孔板中,按以下分組分別干預(yù)

2、24h、48h、72h,細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測細(xì)胞活化標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá),確定AngⅡ引起NRK-49F細(xì)胞活化的最佳作用濃度及作用時間。實驗分組:①對照組；②AngⅡ10-7mol／L組:③AngⅡ10-6mol／L組；④AngⅡ10-5mol／L組；實驗結(jié)果表明以含AngⅡ10-6mol／L的培養(yǎng)基干預(yù)72h活化細(xì)胞最佳。(2)確定Ang-(1-7)抑制AngⅡ引起的NRK-49F細(xì)胞活化的最佳作用濃度。以上

3、述相同方法將NRK-49F細(xì)胞接種于六孔板中,再以含AngⅡ10-6mol／L和不同濃度Ang-(1-7)的培養(yǎng)基按以下分組培養(yǎng)細(xì)胞:①AngⅡ+Ang-(1-7)10-7mol／L組:②AngⅡ+Ang-(1-7)10-6mol／L組；③AngⅡ+Ang-(1-7)10-5mol／L組；培養(yǎng)72h后同樣以細(xì)胞免疫化學(xué)染色法觀察不同濃度Ang-(1-7)對AngⅡ誘導(dǎo)的NRK-49F細(xì)胞活化的影響,確定Ang-(1-7)抑制AngⅡ引起

4、的NRK-49F細(xì)胞活化的最佳作用濃度。實驗結(jié)果表明Ang-(1-7)10-5mol／L對AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞活化抑制最佳。
　　 實驗二:Ang-(1-7)對AngⅡ誘導(dǎo)的NRK-49F細(xì)胞活化的影響。以含AngⅡ終濃度為10-6mol／L,Ang-(1-7)終濃度為10-5mol／L的培養(yǎng)基按以下分組培養(yǎng)細(xì)胞①對照組:細(xì)胞培養(yǎng)基中不加干預(yù)因素；②AngⅡ組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入AngⅡ；③Ang-(1-7)組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入An

5、g-(1-7)；④AngⅡ+Ang-(1-7)組:細(xì)胞培養(yǎng)基中同時加入AngⅡ和Ang-(1-7)。按上述分組培養(yǎng)72h后,進(jìn)行如下檢測:①應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測α-SMA及細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF—Ⅰ)的表達(dá)；②應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測上清液中細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原(ColⅠ)和細(xì)胞因子TGF-β1、IGF-Ⅰ的含量。
　　 結(jié)果:
　　 實驗一(1):An

6、gⅡ引起NRK-49F細(xì)胞活化的最佳作用濃度及作用時間。對照組細(xì)胞只有基礎(chǔ)量的α—SMA表達(dá),隨培養(yǎng)時間的延長α—SMA的表達(dá)無明顯變化(P<0.05)；其余AngⅡ干預(yù)組細(xì)胞α—SMA的表達(dá)隨AngⅡ濃度升高,干預(yù)時間的延長而增加。72h后,AngⅡ10-6mol／L干預(yù)組α—SMA表達(dá)最強(qiáng),但與AngⅡ10-5mol／L干預(yù)組的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(2)Ang-(1-7)抑制AngⅡ引起的NRK-49F細(xì)胞活化的最佳作

7、用濃度。培養(yǎng)72h后,NRK-49F細(xì)胞α—SMA的表達(dá)隨Ang-(1-7)濃度升高而減少,各組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AngⅡ10-6mol／L+Ang-(1-7)10-5mol／L干預(yù)組細(xì)胞α—SMA表達(dá)最少。
　　 實驗二:(1)細(xì)胞免疫化學(xué)檢測結(jié)果:①腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)的變化:培養(yǎng)72h后,對照組只有基礎(chǔ)水平的α—SMA表達(dá),Ang-(1-7)組與之類似；AngⅡ組細(xì)胞α—SMA表達(dá)

8、較對照組顯著增加(P<0.05),AngⅡ+Ang-(1-7)組與AngⅡ組比較,細(xì)胞α—SMA表達(dá)明顯減少(P<0.05)；②細(xì)胞因子TGF-β1、IGF-Ⅰ表達(dá)的變化:培養(yǎng)72h后,對照組細(xì)胞幾無TGF-β1、IGF—Ⅰ陽性表達(dá),Ang-(1-7)組與之類似；AngⅡ組細(xì)胞與對照組比較,TGF-β1、IGF-Ⅰ表達(dá)顯著增加(P<0.05),AngⅡ+Ang-(1-7)組與AngⅡ組比較,細(xì)胞TGF-β1、IGF-Ⅰ表達(dá)明顯減少(P<

9、0.05)。(2)ELISA檢測結(jié)果:培養(yǎng)72h后,Ang-(1-7)組與對照組比較,細(xì)胞上清液中ColⅠ和TGF-β1、IGF-Ⅰ的含量無明顯改變,AngⅡ組與對照組比較,細(xì)胞上清液中ColⅠ和TGF—β1、IGF—Ⅰ明顯升高(P<0.05)；與AngⅡ組比較,AngⅡ+Ang-(1-7)組細(xì)胞上清液中ColⅠ和TGF-β1、IGF-Ⅰ含量明顯減少(P<0.05)。
　　 結(jié)論:(1)Ang-(1-7)能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的腎間