2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:我國是一個肝病大國,慢性肝病的發(fā)生率相對較高,而肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經病理改變。肝纖維化具有可逆性,因此,盡早地阻斷和延緩肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展,在一定程度上能有效地控制肝硬化的形成。探討肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機制,尋找有效的抗肝纖維化藥物是關系人類生命健康的重大課題,具有重要而深遠的臨床意義和社會價值。肝纖維化(hepaticfibrosis,HF)是指肝細胞發(fā)生壞死時,活化的成纖維細胞或肌成纖維細胞增多,肝臟中膠原

2、蛋白等細胞外基質(extracellularmatrix,ECM)的增生與降解失衡,導致肝臟內纖維結締組織大量沉積的病理改變。肝纖維化是由多種細胞因子、生長因子和氧化應激等一系列復雜作用的結果。研究發(fā)現(xiàn),在肝損傷過程中,肝內三種細胞即肝細胞、膽管上皮細胞和靜息性肝星狀細胞(Q-HSC)均可受各種細胞因子的調控發(fā)生表型轉變,獲得肌成纖維細胞(myofibroblast,MFb)特征,表明肝纖維化過程中伴有上皮-間質轉換。上皮-間質轉換(e

3、pithelial mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞在形態(tài)、結構、粘附及遷移能力等方面獲得間質細胞特性的過程。其主要表現(xiàn)為:上皮細胞表型基因如E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達下調;間質細胞表型基因如波形蛋白(vimentin)表達上調;間質細胞功能基因如Ⅰ型膠原(collagenⅠ)表達增強等。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system,RAS)是近年來肝纖維化領域的

4、又一研究熱點。研究表明,肝內ACE-AngⅡ-AT1R軸與肝纖維化的形成有著密切的聯(lián)系。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是RAS的重要效應分子,它通過激活肝星狀細胞、匯管區(qū)的肌成纖維細胞及骨髓源性間質細胞等諸多致肝纖維化的潛力細胞,進而促進肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),AngⅡ可以誘導人肝細胞系(HL-7702)發(fā)生上皮-間質轉換。因此,本論文通過體外實驗進一步觀察AngⅡ是否也可以誘導原代大鼠肝細胞發(fā)生

5、上皮-間質轉換;同時觀察AngⅡ作用于大鼠肝細胞系(BRL-3A)后,細胞遷移能力是否發(fā)生改變。隨著人們對RAS認識的不斷深化,逐漸發(fā)現(xiàn)了RAS的許多新的組分,如血管緊張素轉換酶2(ACE2)、血管緊張素1-7(Ang(1-7)、Ang(1-7)的受體Mas等,它們構成的ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸,成為RAS的另一重要分支,對ACE-AngⅡ-AT1R軸具有顯著的抑制作用。Ang(1-7)在體內外能與AT1R競爭性結合,拮

6、抗AngⅡ的活性,發(fā)揮抗纖維化的作用。因此,本論文通過體內和體外實驗,觀察ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸是否可以抑制AngⅡ的作用,抑制肝細胞上皮-間質轉換的發(fā)生,發(fā)揮抗肝纖維化作用。
   方法:⑴分離培養(yǎng)原代大鼠肝細胞,予不同濃度的AngⅡ刺激原代大鼠肝細胞48h后,免疫蛋白質印跡(Western Blot)法檢測各組中collagen、vimentin、E-cadherin蛋白表達水平的變化;分組為:對照組、10

7、-9rmmol/L AngⅡ處理組、10-7mmol/LAngⅡ處理組,實驗重復3次。分離培養(yǎng)原代大鼠肝細胞,予10-7mol/L AngⅡ分別于24小時、48小時、72小時不同時間點處理原代大鼠肝細胞,免疫蛋白質印跡(Western Blot)法檢測各組中collagen、vimentin、E-cadherin蛋白表達水平的變化;分組為:24小時對照組、AngⅡ處理24小時組、48小時對照組、AngⅡ處理48小時組、72小時對照組、A

8、ngⅡ處理72小時組,實驗重復3次。AngⅡ刺激大鼠肝細胞系(BRL-3A)48小時后,Transwell侵襲實驗法觀察細胞遷移能力的改變;分組為:對照組、AngⅡ刺激組,實驗重復3次。⑵分離培養(yǎng)原代大鼠肝細胞,予不同刺激處理原代大鼠肝細胞,免疫蛋白質印跡(Western Blot)法檢測各組中vimentin、E-cadherin蛋白表達水平的變化;分組為:對照組、AngⅡ刺激組、Ang(1-7)刺激組、AngⅡ+Ang(1-7)處理

9、組、AngⅡ+Ang(1-7)+A779處理組,實驗重復3次。⑶構建lentiACE2慢病毒載體,并轉染大鼠肝細胞系(BRL-3A),免疫蛋白質印跡(Western Blot)法檢測各組中collagen、vimentin、E-cadherin、albumin蛋白表達水平的變化;分組為:對照組、lentiGFP組、lentiACE2組、lentiACE2+A779處理組,實驗重復3次。構建lentiACE2慢病毒載體,并轉染大鼠肝細胞系

10、(BRL-3A),予不同刺激處理后,免疫蛋白質印跡(Western Blot)法檢測各組中vimentin、albumin蛋白表達水平的變化;分組為:對照組、lentiGFP組、lentiACE2組、lentiGFP+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ+A779處理組、AngⅡ刺激組,實驗重復3次。構建lentiACE2慢病毒載體,并轉染大鼠肝細胞系(BRL-3A),予不同刺激處理后,Tra

11、nswell侵襲實驗法觀察細胞遷移能力的改變;分組為:對照組、lentiGFP組、lentiACE2組、lentiGFP+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ+A779處理組、AngⅡ刺激組,實驗重復3次。⑷Wistar大鼠構建假手術組大鼠模型(sham)、膽管結扎肝纖維化組大鼠模型(BDL)及BDL基礎上Ang(1-7)治療組模型(BDL+Ang(1-7),對肝組織進行ISHAK及METAV

12、IR肝纖維化評分和Masson染色。⑸將人肝組織冰凍切片進行albumin+collagen免疫熒光雙染;分組為:正常組、肝纖維化組,進一步觀察肝細胞是否發(fā)生上皮-間質轉換。
   結果:⑴不同濃度的AngⅡ刺激原代大鼠肝細胞48h,與對照組相比,10-9mmol/LAngn組和10-7mmol/L AngⅡ組肝細胞中E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05),collagen、vimentin蛋白表達增多(P<0.05)

13、;與10-9mmol/L AngⅡ組相比,10-7mmol/L AngⅡ組肝細胞中E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05); collagen、vimentin蛋白表達增多(P<0.05)。不同時間點10-7mmol/LAngⅡ處理原代大鼠肝細胞,培養(yǎng)24小時,與對照組相比,AngⅡ刺激組原代大鼠肝細胞間質標志collagen、vimentin蛋白增加不明顯,無統(tǒng)計學意義,上皮標志E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05)

14、,差異有統(tǒng)計學意義;培養(yǎng)48小時,AngⅡ刺激組與對照組相比,collagen、vimentin蛋白明顯增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義,E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;培養(yǎng)72小時,AngⅡ刺激組與對照組相比,collagen蛋白增加不明顯,無統(tǒng)計學意義,vimentin蛋白明顯增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義,E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。AngⅡ

15、刺激大鼠肝細胞系(BRL-3A)48小時后,AngⅡ刺激組遷移細胞數(shù)較對照組遷移細胞數(shù)明顯增多(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。⑵分離培養(yǎng)原代大鼠肝細胞,予不同刺激處理48h后,與對照組相比,AngⅡ刺激組的E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05),vimentin蛋白表達增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;與AngⅡ組相比,AngⅡ+Ang(1-7)處理組E-cadherin蛋白表達增加(P<0.05),vimentin

16、蛋白表達減少(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;與AngⅡ+Ang(1-7)處理組相比,AngⅡ+Ang(1-7)+A779處理組E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05),virnentin蛋白表達增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。⑶本實驗成功構建lentiACE2慢病毒載體,并轉染進入大鼠肝細胞系(BRL-3A)中。與對照組相比,轉染ACE2慢病毒的大鼠肝細胞albumin和上皮標志E-cadherin蛋白表達明顯增加(

17、P<0.05),間質標志collagen、vimentin蛋白表達降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;AngⅡ干預慢病毒ACE2轉染的BRL-3A細胞,析因分析結果示:病毒轉染及AngⅡ兩因素間存在交互效應,ACE2轉染組能顯著抑制AngⅡ引起的albumin表達下降、vimentin表達上調。⑷通過對Sham組、BDL組及BDL+Ang(1-7)組大鼠肝組織Masson染色進行ISHAK及METAVIR肝纖維化評分發(fā)現(xiàn),BDL組模

18、型組膠原纖維染色及肝纖維化評分顯著高于Sham組(P=0.000),差異有統(tǒng)計學意義;而BDL+Ang(1-7)組膠原纖維染色及肝纖維化評分顯著低于BDL模型組(P=0.000),差異有統(tǒng)計學意義。但兩者均較Sham組高。⑸人肝組織冰凍切片albumin+collagen免疫熒光雙染結果顯示:正常組中同時表達albumin(綠色)和collagen(紅色)的細胞較少,而肝纖維化組中同時表達albumin(綠色)和collagen(紅色)

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