版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、目的:我國是一個肝病大國,慢性肝病的發(fā)生率相對較高,而肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經病理改變。肝纖維化具有可逆性,因此,盡早地阻斷和延緩肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展,在一定程度上能有效地控制肝硬化的形成。探討肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機制,尋找有效的抗肝纖維化藥物是關系人類生命健康的重大課題,具有重要而深遠的臨床意義和社會價值。肝纖維化(hepaticfibrosis,HF)是指肝細胞發(fā)生壞死時,活化的成纖維細胞或肌成纖維細胞增多,肝臟中膠原
2、蛋白等細胞外基質(extracellularmatrix,ECM)的增生與降解失衡,導致肝臟內纖維結締組織大量沉積的病理改變。肝纖維化是由多種細胞因子、生長因子和氧化應激等一系列復雜作用的結果。研究發(fā)現(xiàn),在肝損傷過程中,肝內三種細胞即肝細胞、膽管上皮細胞和靜息性肝星狀細胞(Q-HSC)均可受各種細胞因子的調控發(fā)生表型轉變,獲得肌成纖維細胞(myofibroblast,MFb)特征,表明肝纖維化過程中伴有上皮-間質轉換。上皮-間質轉換(e
3、pithelial mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞在形態(tài)、結構、粘附及遷移能力等方面獲得間質細胞特性的過程。其主要表現(xiàn)為:上皮細胞表型基因如E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達下調;間質細胞表型基因如波形蛋白(vimentin)表達上調;間質細胞功能基因如Ⅰ型膠原(collagenⅠ)表達增強等。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system,RAS)是近年來肝纖維化領域的
4、又一研究熱點。研究表明,肝內ACE-AngⅡ-AT1R軸與肝纖維化的形成有著密切的聯(lián)系。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是RAS的重要效應分子,它通過激活肝星狀細胞、匯管區(qū)的肌成纖維細胞及骨髓源性間質細胞等諸多致肝纖維化的潛力細胞,進而促進肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),AngⅡ可以誘導人肝細胞系(HL-7702)發(fā)生上皮-間質轉換。因此,本論文通過體外實驗進一步觀察AngⅡ是否也可以誘導原代大鼠肝細胞發(fā)生
5、上皮-間質轉換;同時觀察AngⅡ作用于大鼠肝細胞系(BRL-3A)后,細胞遷移能力是否發(fā)生改變。隨著人們對RAS認識的不斷深化,逐漸發(fā)現(xiàn)了RAS的許多新的組分,如血管緊張素轉換酶2(ACE2)、血管緊張素1-7(Ang(1-7)、Ang(1-7)的受體Mas等,它們構成的ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸,成為RAS的另一重要分支,對ACE-AngⅡ-AT1R軸具有顯著的抑制作用。Ang(1-7)在體內外能與AT1R競爭性結合,拮
6、抗AngⅡ的活性,發(fā)揮抗纖維化的作用。因此,本論文通過體內和體外實驗,觀察ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸是否可以抑制AngⅡ的作用,抑制肝細胞上皮-間質轉換的發(fā)生,發(fā)揮抗肝纖維化作用。
方法:⑴分離培養(yǎng)原代大鼠肝細胞,予不同濃度的AngⅡ刺激原代大鼠肝細胞48h后,免疫蛋白質印跡(Western Blot)法檢測各組中collagen、vimentin、E-cadherin蛋白表達水平的變化;分組為:對照組、10
7、-9rmmol/L AngⅡ處理組、10-7mmol/LAngⅡ處理組,實驗重復3次。分離培養(yǎng)原代大鼠肝細胞,予10-7mol/L AngⅡ分別于24小時、48小時、72小時不同時間點處理原代大鼠肝細胞,免疫蛋白質印跡(Western Blot)法檢測各組中collagen、vimentin、E-cadherin蛋白表達水平的變化;分組為:24小時對照組、AngⅡ處理24小時組、48小時對照組、AngⅡ處理48小時組、72小時對照組、A
8、ngⅡ處理72小時組,實驗重復3次。AngⅡ刺激大鼠肝細胞系(BRL-3A)48小時后,Transwell侵襲實驗法觀察細胞遷移能力的改變;分組為:對照組、AngⅡ刺激組,實驗重復3次。⑵分離培養(yǎng)原代大鼠肝細胞,予不同刺激處理原代大鼠肝細胞,免疫蛋白質印跡(Western Blot)法檢測各組中vimentin、E-cadherin蛋白表達水平的變化;分組為:對照組、AngⅡ刺激組、Ang(1-7)刺激組、AngⅡ+Ang(1-7)處理
9、組、AngⅡ+Ang(1-7)+A779處理組,實驗重復3次。⑶構建lentiACE2慢病毒載體,并轉染大鼠肝細胞系(BRL-3A),免疫蛋白質印跡(Western Blot)法檢測各組中collagen、vimentin、E-cadherin、albumin蛋白表達水平的變化;分組為:對照組、lentiGFP組、lentiACE2組、lentiACE2+A779處理組,實驗重復3次。構建lentiACE2慢病毒載體,并轉染大鼠肝細胞系
10、(BRL-3A),予不同刺激處理后,免疫蛋白質印跡(Western Blot)法檢測各組中vimentin、albumin蛋白表達水平的變化;分組為:對照組、lentiGFP組、lentiACE2組、lentiGFP+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ+A779處理組、AngⅡ刺激組,實驗重復3次。構建lentiACE2慢病毒載體,并轉染大鼠肝細胞系(BRL-3A),予不同刺激處理后,Tra
11、nswell侵襲實驗法觀察細胞遷移能力的改變;分組為:對照組、lentiGFP組、lentiACE2組、lentiGFP+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ+A779處理組、AngⅡ刺激組,實驗重復3次。⑷Wistar大鼠構建假手術組大鼠模型(sham)、膽管結扎肝纖維化組大鼠模型(BDL)及BDL基礎上Ang(1-7)治療組模型(BDL+Ang(1-7),對肝組織進行ISHAK及METAV
12、IR肝纖維化評分和Masson染色。⑸將人肝組織冰凍切片進行albumin+collagen免疫熒光雙染;分組為:正常組、肝纖維化組,進一步觀察肝細胞是否發(fā)生上皮-間質轉換。
結果:⑴不同濃度的AngⅡ刺激原代大鼠肝細胞48h,與對照組相比,10-9mmol/LAngn組和10-7mmol/L AngⅡ組肝細胞中E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05),collagen、vimentin蛋白表達增多(P<0.05)
13、;與10-9mmol/L AngⅡ組相比,10-7mmol/L AngⅡ組肝細胞中E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05); collagen、vimentin蛋白表達增多(P<0.05)。不同時間點10-7mmol/LAngⅡ處理原代大鼠肝細胞,培養(yǎng)24小時,與對照組相比,AngⅡ刺激組原代大鼠肝細胞間質標志collagen、vimentin蛋白增加不明顯,無統(tǒng)計學意義,上皮標志E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05)
14、,差異有統(tǒng)計學意義;培養(yǎng)48小時,AngⅡ刺激組與對照組相比,collagen、vimentin蛋白明顯增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義,E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;培養(yǎng)72小時,AngⅡ刺激組與對照組相比,collagen蛋白增加不明顯,無統(tǒng)計學意義,vimentin蛋白明顯增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義,E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。AngⅡ
15、刺激大鼠肝細胞系(BRL-3A)48小時后,AngⅡ刺激組遷移細胞數(shù)較對照組遷移細胞數(shù)明顯增多(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。⑵分離培養(yǎng)原代大鼠肝細胞,予不同刺激處理48h后,與對照組相比,AngⅡ刺激組的E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05),vimentin蛋白表達增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;與AngⅡ組相比,AngⅡ+Ang(1-7)處理組E-cadherin蛋白表達增加(P<0.05),vimentin
16、蛋白表達減少(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;與AngⅡ+Ang(1-7)處理組相比,AngⅡ+Ang(1-7)+A779處理組E-cadherin蛋白表達減少(P<0.05),virnentin蛋白表達增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。⑶本實驗成功構建lentiACE2慢病毒載體,并轉染進入大鼠肝細胞系(BRL-3A)中。與對照組相比,轉染ACE2慢病毒的大鼠肝細胞albumin和上皮標志E-cadherin蛋白表達明顯增加(
17、P<0.05),間質標志collagen、vimentin蛋白表達降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;AngⅡ干預慢病毒ACE2轉染的BRL-3A細胞,析因分析結果示:病毒轉染及AngⅡ兩因素間存在交互效應,ACE2轉染組能顯著抑制AngⅡ引起的albumin表達下降、vimentin表達上調。⑷通過對Sham組、BDL組及BDL+Ang(1-7)組大鼠肝組織Masson染色進行ISHAK及METAVIR肝纖維化評分發(fā)現(xiàn),BDL組模
18、型組膠原纖維染色及肝纖維化評分顯著高于Sham組(P=0.000),差異有統(tǒng)計學意義;而BDL+Ang(1-7)組膠原纖維染色及肝纖維化評分顯著低于BDL模型組(P=0.000),差異有統(tǒng)計學意義。但兩者均較Sham組高。⑸人肝組織冰凍切片albumin+collagen免疫熒光雙染結果顯示:正常組中同時表達albumin(綠色)和collagen(紅色)的細胞較少,而肝纖維化組中同時表達albumin(綠色)和collagen(紅色)
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 血管緊張素Ⅱ對人肝細胞上皮-間質表型轉換的影響及作用機制.pdf
- 血管緊張素轉換酶-2抑制肺癌細胞上皮—間質轉化過程及其對肺癌轉移作用研究.pdf
- 益氣養(yǎng)陰法對IgA腎病大鼠血管緊張素Ⅱ和血管緊張素轉換酶的影響.pdf
- 葛根素抑制血管緊張素轉換酶2(ACE2)的促血管生成作用.pdf
- 血管緊張素轉換酶抑制劑acei
- 血管緊張素轉換酶和血管緊張素轉換酶2在自發(fā)性高血壓大鼠中的表達及其受依那普利的影響.pdf
- 人血管緊張素轉換酶ace酶聯(lián)免疫分析
- 低氧對人血管內皮細胞血管緊張素轉換酶2表達影響的研究.pdf
- 血管緊張素轉換酶和血管緊張素原基因多態(tài)性與冠心病的關系.pdf
- 替米沙坦和血管緊張素Ⅱ對胸主動脈血管緊張素轉換酶-2表達的影響.pdf
- 具有血管緊張素轉換酶抑制活性的益生菌篩選.pdf
- 血管緊張素轉換酶抑制劑的分子設計.pdf
- 血管緊張素-(1-7)對血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠腎小管上皮細胞轉分化的影響.pdf
- 體外培養(yǎng)的牛眼小梁細胞血管緊張素轉換酶的表達.pdf
- 血管緊張素-(1-7)對血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠腎間質成纖維細胞活化的影響.pdf
- 血管緊張素轉換酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑在腹膜透析患者中的作用.pdf
- 血管緊張素原和血管緊張素轉換酶基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關研究.pdf
- 脂多糖對大鼠肺微血管內皮細胞血管緊張素轉換酶2表達的影響.pdf
- 血管緊張素轉換酶和血管緊張素原基因多態(tài)性與冠心病相關性研究.pdf
- 血管緊張素轉換酶抑制劑acei的臨床藥學特征
評論
0/150
提交評論