血管緊張素-（1-7）對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞增殖與細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響.pdf

1、目的：探討血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞(GMC)增殖與細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響，并初步了解Ang-(1-7)的作用受體。 方法：將生長(zhǎng)在96孔培養(yǎng)板上無(wú)血清靜止培養(yǎng)24h的大鼠GMC培養(yǎng)液，按以下分組加入不同干擾因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。①對(duì)照組：GMC培養(yǎng)液中不加干擾因素；②AngⅡ組：加入AngⅡ10-7mol/L；③Ang-(1-7)組：加入Ang-(1-7)10-6mol/L；④

2、Ang-(1-7)+AngⅡ組：在加入AngⅡ10-7mol/L的基礎(chǔ)上，分別加入Ang-(1-7)10-6mol/L；Ang-(1-7)10-7mol/L；Ang-(1-7)10-8mol/L；Ang-(1-7)10-9mol/L；⑤AngⅡ受體1(AT1受體)拮抗劑[Sar1，Ile8]-AngⅡ+Ang-(1-7)組：先用[Sar1，Ile8]-AngⅡ(10-6mol/L)預(yù)處理30分鐘后，再加入Ang-(1-7)10-6mol

3、/L；⑥血管緊張素Ⅱ受體2(AT2受體)拮抗劑PD123319+Ang-(1-7)組：先用PD123319(10-5mol/L)預(yù)處理30分鐘后，再加入Ang-(1-7)10-6mol/L。每組設(shè)6個(gè)復(fù)管，放入培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。通過(guò)3[H]-Thymidine及3[H]-Leucine摻入分別測(cè)定GMC的DNA、蛋白質(zhì)合成：按上述分組加入不同干預(yù)藥物的同時(shí)，在96孔板加入37kBq3[H]thymidine共同培養(yǎng)24h，移去培養(yǎng)液

4、并用預(yù)冷的100g/L三氯乙酸于4C固定30min，然后用平衡鹽溶液洗2次，最后用10g/LSDS0.1mol/LNaOH溶液0.1mL裂解細(xì)胞，37C放置過(guò)夜，收集細(xì)胞裂解液至有閃爍液的測(cè)量杯中，搖勻放置待其溶解后于FJ-2107P液體閃爍儀測(cè)定放射性核數(shù)計(jì)數(shù)率(cpm/Well)。用3[H]Leucine代替3[H]thymidine，進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的測(cè)定；用結(jié)晶紫染色的方法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目：按上述分組加入不同干預(yù)藥物，在96孔板培養(yǎng)4

5、8h，加0.1ml5％(50g/L)的戊二醛液固定細(xì)胞15min，0.1ml去離子水沖洗3遍，用新配制的1g/L的結(jié)晶紫染色20min，用0.1ml去離子水沖洗3遍，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入0.1mlTritonX-100以提取被細(xì)胞核吸收的結(jié)晶紫液，用分光光度計(jì)在630nm處測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)孔的吸光(A)值；放免法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅲ型前膠原(PcⅢ)和透明質(zhì)酸(HA)的含量：按上述分組加入不同干預(yù)藥物后48小時(shí)，吸取培養(yǎng)上清液至2ml小試管中

6、，立即用放免法分別檢測(cè)PcⅢ及HA的含量，均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，各組均數(shù)用單因素方差分析及兩兩均數(shù)q檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差異均以p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：AngⅡ誘導(dǎo)大鼠GMCDNA和蛋白質(zhì)合成，Ang-(1-7)則明顯抑制系膜細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)合成增加；濃度為10-9mol/L至10-6mol/L的Ang-(1-7)抑制AngⅡ誘導(dǎo)大鼠GMC的DNA和蛋白質(zhì)合成作用逐漸增強(qiáng)，用

7、[Sar1，Ile8]-AngⅡ和PD123319分別預(yù)處理30min后加Ang-(1-7)，對(duì)Ang-(1-7)抑制大鼠GMC的DNA和蛋白質(zhì)合成作用無(wú)顯增影響，與單獨(dú)Ang-(1-7)組比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；AngⅡ可誘導(dǎo)GMC增殖(P＜0.05)，Ang-(1-7)10-6mol/L抑制GMC增殖(P＜0.05)，且Ang-(1-7)呈劑量依賴性地抑制AngⅡ的促系膜細(xì)胞增殖作用。[Sar1，Ile8]-AngⅡ

8、與PD123319分別預(yù)處理30min后加Ang-(1-7)，對(duì)Ang-(1-7)抑制大鼠GMC的增殖作用無(wú)顯著影響，與單獨(dú)Ang-(1-7)組比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；用放免法檢測(cè)各組處理48小時(shí)后細(xì)胞上清液中透明質(zhì)酸(HA)及Ⅲ型前膠原(PcⅢ)的含量：AngⅡ誘導(dǎo)GMC分泌HA及PcⅢ，Ang-(1-7)10-6mol/L抑制GMCHA及PcⅢH的分泌(P＜0.05)，且Ang-(1-7)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)GMCHA及P

9、cⅢ分泌的抑制呈劑量依賴性增強(qiáng)。[Sar1，Ile8]-AngⅡ與PD123319分別預(yù)處理30min后加Ang-(1-7)，對(duì)Ang-(1-7)抑制大鼠GMCHA及PcⅢ的分泌增加無(wú)顯著影響，與單獨(dú)Ang-(1-7)組比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。 結(jié)論：①AngⅡ誘導(dǎo)GMCDNA、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞數(shù)目增加與細(xì)胞外基質(zhì)PcⅢ、HA的分泌；②Ang-(1-7)抑制GMCDNA、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞數(shù)目增加與細(xì)胞外基質(zhì)PcⅢ