血管緊張素-（1-7）對轉(zhuǎn)化生長因子-β-,1-誘導(dǎo)的大鼠腎小系膜細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)增殖的影響并初步探討其機(jī)制。 方法:將培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制成5×104/mL的細(xì)胞懸液，接種在96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100μL無血清培養(yǎng)24小時(shí)，使其生長同步化。當(dāng)細(xì)胞生長融合至70％左右時(shí)，按以下分組加入不同干預(yù)因素。A組(對照組):GMC培養(yǎng)液中不加入干預(yù)因素；B

2、組(TGF-β1組):GMC培養(yǎng)液中加入TGF-β1(終濃度5ng/ml；C組[Ang-(1-7)組]:GMC培養(yǎng)液中加入Ang-(1-7)(終濃度10-6 mol/L)；D組[TGF-β1+Ang-(1-7)組]:GMC培養(yǎng)液中加入TGF-β1(終濃度5ng/ml)及Ang-(1-7)(終濃度10-6m0l/L)。(1)WST法檢測GMC增殖；藥物干預(yù)24小時(shí)后，每孔加入WST 10μL，37℃繼續(xù)孵育4h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上490n

3、m波長處測定OD值。(2)RT-PCR法檢測Smad3/7及CTGF等基因mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)濃度同上，將培養(yǎng)的GMC接種在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長融合至70％左右時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)，干預(yù)24小時(shí)后，按RNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物15μL于1.5％瓊脂糖凝膠中以100V電壓進(jìn)行電泳，5×TBE作為電泳緩沖液，電泳時(shí)間為40min，用凝膠成像掃描及分析系統(tǒng)，測定

4、各組目的基因與內(nèi)參基因的積分光密度比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，采用單因素方差分析(F檢驗(yàn)和q檢驗(yàn))進(jìn)行組間比較，P<0.05表示差異有顯著性。采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:(1)WST法檢測GMC增殖結(jié)果:與對照組相比，TGF-β1(5ng/ml)可明顯促進(jìn)GMC增殖(P<0.05)；Ang-(1-7)(10-6mol/L)則可明顯抑制基礎(chǔ)狀態(tài)下的GMC增殖(P<0.05)；同時(shí)Ang-(1-7)對TGF

5、-β1的促細(xì)胞增殖作用也有顯著的抑制作用(P<0.05)；(2)Smad3/7，CTGF mRNA表達(dá)結(jié)果:與對照組相比，TGF-β1(5ng/ml)可明顯促進(jìn)GMC Smad3，Smad7，CTGF mRNA的表達(dá)(P<0.05)；Ang-(1-7)(10-6mol/L)則明顯抑制基礎(chǔ)狀態(tài)下GMC Smad3，CTGF mRNA的表達(dá)(P<0.05)，但對基礎(chǔ)狀態(tài)下的Smad7 mRNA表達(dá)無明顯的影響(P>0.05)；Ang-(1-

6、7)對TGF-β1所誘導(dǎo)的Smad3，Smad7，CTGF mRNA的表達(dá)均有明顯的抑制作用(P<0.05)。結(jié)論:①Ang-(1-7)可抑制基礎(chǔ)狀態(tài)下及TGF-β1誘導(dǎo)的GMC增殖。②Ang-(1-7)可抑制基礎(chǔ)狀態(tài)下Smad3，CTGF mRNA的表達(dá)，但對基礎(chǔ)狀態(tài)下的Smad7 mRNA表達(dá)無明顯抑制作用。③Ang-(1-7)可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3，Smad7，CTGF mRNA的表達(dá)。④Ang-(1-7)通過非特異性