干擾素-α對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β-,1-刺激肝星狀細(xì)胞表達(dá)Smad3及Smad7的影響.pdf

1、目的： 肝纖維化是多種慢性肝病共有的組織學(xué)變化，肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化和增殖是肝纖維化形成的關(guān)鍵和中心環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是調(diào)控肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的核心物質(zhì)。Smads蛋白是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中最重要的胞內(nèi)效應(yīng)因子，它能將TGF-β信號(hào)由胞膜轉(zhuǎn)入核內(nèi)。Smad3過度表達(dá)及Smad7被抑制是肝組織纖維化的主要原因。IFN-α具有抗肝纖維化的作用。至于IFN-α對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Smad

2、蛋白家族是否有影響尚未見報(bào)道。本研究通過檢測(cè)IFN-α對(duì)TGF-β1刺激體外培養(yǎng)的HSC表達(dá)Smad3與Smad7的動(dòng)態(tài)變化，探討IFN-α對(duì)TGF-β1刺激體外培養(yǎng)的HSC表達(dá)Smads蛋白的影響，闡明其抗肝纖維化機(jī)制，為臨床肝纖維化的藥物治療提供更多的理論依據(jù)。 材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、大鼠肝臟星狀細(xì)胞株(r-HSC99) 由北京大學(xué)人民醫(yī)院冷希圣教授惠贈(zèng)，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院感染科研究

3、室保存。r-HSC99是經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)，傳代后自發(fā)產(chǎn)生的，符合HSC的自然特征，是研究肝纖維化理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?2、主要試劑 TGF-β1；重組人干擾素-α2b；β-actin引物、Smad3引物、Smad7引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；羊抗大鼠Smad3多克隆抗體；羊抗大鼠Smad7多克隆抗體。兔抗山羊IgG抗體。 二、實(shí)驗(yàn)方法 體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞系r-HSC99，分為TGF-β1組、TGF-β1+IFN-α組

4、。分別應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法和免疫印跡(Western blotting)方法，測(cè)定各組于培養(yǎng)0、2、4、8、16、24小時(shí)，HSC表達(dá)Smad3、Smad7的mRNA及蛋白變化。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間是否存在顯著性差異分析采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、HSC表達(dá)Smad3、Smad

5、7 mRNA的結(jié)果 0小時(shí)的Smad3 mRNA/β-actine值為0.524±0.022，TGF-β1組2、4、8、16、24小時(shí)Smad3 mRNA/β-actine值分別為0.591±0.039、0.761±0.023、0.896±0.033、0.779±0.020、0.648±0.037；IFN-α+ TGF-β1組2、4、8、16、24小時(shí)Smad3mRNA/β-actine值分別為0.562±0.038、0.593

6、±0.033、0.705±0.031、0.647±0.020、0.579±0.024。在TGF-β1作用下，隨著時(shí)間的增加，兩組Smad3 mRNA表達(dá)均增加，在8小時(shí)達(dá)到高峰，之后開始下降，與0小時(shí)相比，Smad3 mRNA在4、8、16、24小時(shí)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IFN-α+TGF-β1組與TGF-β1組按時(shí)間相比，IFN-α+ TGF-β1組Smad3 mRNA表達(dá)低于TGF-β1組，在4、8、16小時(shí)組差異均

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 0小時(shí)的Smad7 mRNA/β-actine值為0.513±0.135，TGF-β1組2、4、8、16、24小時(shí)Smad7 mRNA/β-actine值分別為0.604±0.034、0.764±0.022、0.855±0.027、0.775±0.032、0.668±0.033；IFN-α+ TGF-β1組2、4、8、16、24小時(shí)Smad7mRNA/β-actine值分別為0.672±0.029

8、、0.949±0.038、1.126±0.026、0.933±0.015、0.631±0.088。隨著時(shí)間的增加，兩組Smad7 mRNA表達(dá)均增加，在8小時(shí)達(dá)到高峰，之后開始下降，與0小時(shí)相比，Smad7 mRNA在4、8、16小時(shí)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IFN-α+ TGF-β1組與TGF-β1組按時(shí)間相比，IFN-α+ TGF-β1組Smad7 mRNA表達(dá)高于TGF-β1組，在4、8、16小時(shí)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

9、P<0.05)。 2、HSC表達(dá)Smad3、Smad7蛋白的結(jié)果 0小時(shí)的Smad3蛋白/β-actine值為0.291±0.031，TGF-β1組2、4、8、16、24小時(shí)Smad3蛋白/β-actine值分別為0.321±0.055、0.393±0.034、0.569±0.035、0.556±0.034、0.395±0.022；IFN-α+ TGF-β1組2、4、8、16、24小時(shí)Smad3蛋白/β-actine值分

10、別為0.307±0.072、0.390±0，029、0.451±0.027、0.433±0.0220.330±0.026。在TGF-β1作用下，隨著時(shí)間的增加，兩組Smad3蛋白表達(dá)均增加，在8小時(shí)達(dá)到高峰，之后開始下降，與0小時(shí)相比，Smad3蛋白在4、8、16、24小時(shí)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IFN-α+ TGF-β1組與TGF-β1組按時(shí)間相比，IFN-α+ TGF-β1組Smad3蛋白表達(dá)低于TGF-β1組，在4、

11、8、16小時(shí)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 0小時(shí)的Smad7蛋白/β-actine值為0.18±0.010，TGF-β1組2、4、8、16、24小時(shí)Smad7蛋白/β-actine值分別為0.201±0.014、0.270±0.043、0.422±0.035、0.330±0.042、0.259±0.027；IFN-α+ TGF-β1組2、4、8、16、24小時(shí)Smad7蛋白/β-actine值分別為0.182±0.01

12、1、0.303±0.031、0.528±0.049、0.437±0.0370.304±0.030。隨著時(shí)間的增加，兩組Smad7蛋白表達(dá)均增加，在8小時(shí)達(dá)到高峰，之后開始下降，與0小時(shí)相比，Smad7蛋白在4、8、16、24小時(shí)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IFN-α+ TGF-β1組與TGF-β1組按時(shí)間相比，IFN-α+ TGF-β1組Smad7蛋白表達(dá)高于TGF-β1組，在8、16小時(shí)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。