川芎嗪對肝星狀細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB、轉(zhuǎn)化生長因子-β1的影響.pdf

1、目的:研究川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)對人肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cells,HSC)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Neuclear factor-κB,NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforminggrowth factor-β1,TGF-β1)信號傳導(dǎo)的影響。通過檢測α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)蛋白表達(dá)的變化,TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受

2、體、Smad3及Smad7 mRNA表達(dá)的變化,NF-κB p65蛋白表達(dá)以及核轉(zhuǎn)移情況,探討川芎嗪抗肝纖維化作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:1、體外培養(yǎng)HSC:采用表型活化的人肝星狀細(xì)胞Lx-2進(jìn)行體外培養(yǎng)。于含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。2、實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為不同濃度TMP組、陽性對照組、陰性對照組。3、α-SMA表達(dá)的檢測:將Lx-2細(xì)胞懸液接種于

3、培養(yǎng)板,制備細(xì)胞爬片。預(yù)培養(yǎng)24h后分別按擬定劑量加入各組藥物,繼續(xù)培養(yǎng)48h。SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測,抗α-SMA抗體稀釋度為1:100。染色后以半定量分級及評分判定結(jié)果。4、NF-κB表達(dá)及核轉(zhuǎn)移:制備細(xì)胞爬片,分別加入各組藥物后繼續(xù)培養(yǎng)48h,SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測,抗NF-κB p65抗體稀釋度為1:100,根據(jù)染色結(jié)果分析NF-κB表達(dá)及核轉(zhuǎn)移。5、TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受體、Smad3及Smad7 mRNA表達(dá):將L

4、x-2接種于培養(yǎng)板,經(jīng)分組、加藥,培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,并進(jìn)行RNA的定量及純度分析,然后將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后進(jìn)行密度定量。
　　結(jié)果:1、TMP對HSC中α-SMA表達(dá)的影響:與陰性對照組相比,TMP組和陽性對照組Lx-2細(xì)胞中α-SMA表達(dá)顯著降低(P<0.01);TMP200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L濃度組與陽性對照組相比,其差異有顯著性(P<0.05或P<

5、0.01)。這一作用具有良好的劑量相關(guān)性。2、TMP對HSC中NF-κB表達(dá)及核轉(zhuǎn)移的影響:陰性對照組可見細(xì)胞核內(nèi)NF-κB較強(qiáng)陽性表達(dá),TMP組及陽性對照組NF-κB細(xì)胞核陽性表達(dá)不同程度降低;與陰性對照組相比,TMP組和陽性對照組Lx-2細(xì)胞中NF-κB表達(dá)顯著降低(P<0.01);TMP濃度組與陽性對照組相比,其差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)。3、TMP對HSC中TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響:與陰性對照組相比,TM

6、P組、陽性對照組TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量均有顯著性差異(P<0.01);與陽性對照組相比,TMP800 mg/L濃度組TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量顯著降低,差異有顯著性(P<0.01)。4、TMP對HSC中TGF-βⅠ型受體(TβRⅠ)mRNA表達(dá)的影響:與陰性對照組相比,TMP200 mg/L、800 mg/L組TβRⅠmRNA相對表達(dá)量降低,其差異有顯著性(P<0.05或P<0.01);與陽性對照組相比,TMP800 m

7、g/L組TβRⅠmRNA表達(dá)量有顯著性差異(P<0.01)。5、TMP對HSC中TGF-βⅡ型受體(TβRⅡ)mRNA表達(dá)的影響:與陰性對照組相比,陽性對照組及TMP200 mg/L、TMP800 mg/L濃度組的TβRⅡmRNA相對表達(dá)量均有顯著性差異(P<0.01);與陽性對照組相比,TMP200 mg/L、800 mg/L濃度組TβRⅡmRNA表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。6、TMP對HSC中Smad3 mRN

8、A表達(dá)的影響:與陰性對照組相比,陽性對照組Smad3 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05),TMP200 mg/L、800 mg/L濃度組的Smad3 mRNA相對表達(dá)量均有顯著性差異(P<0.01);與陽性對照組相比,TMP800 mg/L濃度組Smad3 mRNA表達(dá)量有顯著性差異(P<0.01)。7、TMP對HSC中Smad7 mRNA表達(dá)的影響:與陰性對照組相比,TMP200mg/L、800 mg/L濃度組Smad7 mRNA

9、表達(dá)量顯著升高,其差異有顯著性(P<0.01);與陽性對照組相比,TMP800 mg/L組Smad7mRNA表達(dá)量的差異具有顯著性(P<0.01)。
　　結(jié)論:川芎嗪可使肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志α-SMA表達(dá)顯著降低,降低NF-κB表達(dá)并抑制其核轉(zhuǎn)移,降低肝星狀細(xì)胞TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受體及Smad3 mRNA表達(dá),同時(shí)促進(jìn)Smad7 mRNA表達(dá),表明川芎嗪可抑制肝星狀細(xì)胞的活化,這可能與阻斷NF-κB信號通路、阻斷TGF-β/S