肥大細胞羧肽酶與類糜蛋白酶在血管生成中的作用的初步研究.pdf

1、[目的]
　　1.建立體內Matrigel血管生成模型，利用該模型研究肥大細胞類糜蛋白酶(mast cell chymase，MC-Chy)的促血管生成作用。
　　2.利用體內Matrigel血管生成模型研究肥大細胞羧肽酶(mast cellcarboxypeptidase，MC-CP)在血管生成中的作用，以及MC-CP對MC-Chy促血管生成作用的影響。
　　[方法]
　　1.建立小鼠體內Matrigel血管生

2、成模型，研究人MC-Chy的促血管生成作用。
　　(1)大量提取人MC-Chy真核表達質粒pcDNA3.1/S-Chy。
　　(2)人MC-Chy真核表達質粒與Matrigel混合后于小鼠腹股溝部皮下注射，建立體內Matrigel血管生成模型，分別設立生理鹽水及MC-Chy抑制劑對照組。
　　(3)實驗第12天處死小鼠，取出膠體組織并切半，一半以4ml/g的比例加入超純水用于血紅蛋白(Hb)及酶活性的測定，另一半用4％

3、甲醛固定常規(guī)包埋切片，用于HE染色和血管內皮細胞(CD34)免疫組織化學(IHC)染色并計數血管密度(MVD)。
　　2.人肥大細胞羧肽酶真核表達質粒(pcDNA3.1/MC-CP)體內表達的研究。
　　(1)分別大量提取人MC-CP分泌型與非分泌型真核表達質粒pcDNA3.1/S-CP、 pcDNA3.1/CP。
　　(2)利用質粒DNA pcDNA3.1/S-CP和pcDNA3.1/CP分別通過皮下及肌肉兩種途徑進

4、行小鼠注射，用ELISA法檢測上述兩種質粒DNA在小鼠體內的表達情況。
　　(3)質粒DNA在體內Matrigel血管生成模型中表達的檢測，質粒DNApcDNA3.1/S-CP和pcDNA3.1/CP分別與Matrigel混合后于小鼠腹股溝皮下注射，實驗的第12天處死小鼠，取出Matrigel檢測是否具有活性MC-CP的表達。
　　3.MC-CP在血管生成中的作用，以及MC-CP對MC-Chy促血管生成作用的影響。
　

5、　(1)分離大鼠腹腔肥大細胞(RPMCs)。
　　(2)用鈣離子載體(A23187)刺激RPMCs，使其活化脫顆粒，產生具有MC-CP與MC-Chy活性的細胞活化產物。
　　(3)利用體內Matrigel血管生成模型，研究MC-CP在血管生成中作用，以及MC-CP對MC-Chy促血管生成作用的影響。
　　[結果]
　　1.成功建立BALB/c小鼠體內Matrigel血管生成模型，用于分析人MC-Chy在血管生成中

6、的作用，膠體組織中可以檢測到具有酶活性的MC-Chy，血紅蛋白(Hb)含量分析顯示，pcDNA3.1/S-Chy表達質粒處理組的Hb含量明顯比對照組高;HE染色及IHC染色發(fā)現pcDNA3.1/S-Chy質粒處理組的血管密度高于對照組，表明人MC-Chy具有促血管生的成作用。而MC-Chy的特異性抑制劑CHI(Chymostatin, CHI)組與對照組沒有顯著差異，提示該作用可以被MC-Chy的特異性抑制劑CHI所抑制。
　　2

7、.質粒DNA pcDNA3.1/S-CP與pcDNA3.1/CP分別通過皮下及肌肉注射兩種途徑進行小鼠注射，ELISA法可以檢測到上述兩種質粒DNA在小鼠體內的表達，而在體內Matrigel血管生成模型中未檢測到具有活性的人MC-CP。
　　3.成功分離RPMCs，用鈣離子載體(A23187)刺激后，獲得具有MC-CP與MC-Chy活性的細胞活化產物，體內Matrigel血管生成模型顯示MC-Chy可以顯著的促進血管生成，而未檢測

8、到MC-CP明顯的促血管生成作用，也未觀察到MC-CP對MC-Chy促血管生成作用的影響。
　　[結論]
　　1.成功建立體內Matrigel血管生成模型，用該模型研究表明人MC-Chy真核表達質粒pcDNA3.1/S-Chy體內表達的MC-Chy具有促血管生成的作用，同時該作用可以被MC-Chy的特異性抑制劑CHI(Chymostatin，CHI)抑制。
　　2.質粒DNA pcDNA3.1/S-CP和pcDNA3.

9、1/CP分別通過皮下及肌肉注射兩種途徑進行小鼠注射，均可以檢測到二者在體內的表達，而在體內Matrigel血管生成模型中未檢測到活性MC-CP的表達，提示該方法可能無法表達出具有活性的人MC-CP。
　　3.體內Matrigel血管生成模型顯示RPMCs活化脫顆粒產生的MC-Chy可以顯著的促進血管生成，而未觀察到RPMCs活化脫顆粒產生的MC-CP有明顯的促血管生成作用，也未觀察到MC-CP對MC-Chy的促血管生成作用有明顯影