肥大細(xì)胞在細(xì)菌性腹瀉中的作用機(jī)制研究.pdf

1、腹瀉的發(fā)病機(jī)制早已得到廣泛討論，但其確切機(jī)制仍需要深入研究。事實(shí)上，腸上皮細(xì)胞對(duì)大量細(xì)菌及其成分已產(chǎn)生耐受性，但是微生物產(chǎn)物是如何打破這種已建立的耐受并誘發(fā)腹瀉和其它炎癥發(fā)生的仍然不很清楚。
　　 肥大細(xì)胞位于宿主和外環(huán)境的表面如皮膚、呼吸道和腸道。肥大細(xì)胞被認(rèn)為是宿主抵御細(xì)菌感染的關(guān)鍵物質(zhì)。但是，微生物產(chǎn)物誘導(dǎo)肥大細(xì)胞介質(zhì)釋放從而導(dǎo)致腹瀉的機(jī)理尚不清楚。
　　 金黃色葡萄球菌（Staphvlococcus aureus

2、，S.aureus）是感染性腹瀉的病因之一。肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）是幾乎所有G+和G-菌的細(xì)胞壁成分，具有很強(qiáng)的免疫活性，它能夠改變免疫細(xì)胞的功能。并可能在細(xì)菌性腹瀉中起關(guān)鍵作用。本研究的目的：1） PGN對(duì)T84細(xì)胞單層（人類腸上皮細(xì)胞系）屏障功能的影響；2）肥大細(xì)胞對(duì)T84屏障功能的影響；3）肥大細(xì)胞系對(duì)PGN吸收途徑；4）口服PGN誘發(fā)小鼠腹瀉模型的建立；5） TLR2（Toll-like receptor，

3、TLR）和NODs（Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）在介導(dǎo)PGN誘發(fā)的腸道肥大細(xì)胞激活過程中的意義；6）肥大細(xì)胞激活在PGN誘導(dǎo)的腹瀉中的必要性。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)和T84細(xì)胞單層功能的檢測(cè)
　　 本實(shí)驗(yàn)采用T84.細(xì)胞單層（T84 Monolayer）細(xì)胞。為了評(píng)估T84細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)PGN，我們把來自金黃色葡萄球菌的純化的PGN及H

4、RP（Horseradish peroxidase，HRP）加入到細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。采用ELISA的方法檢測(cè)樣本中的PGN、HRP。HRP流量作為評(píng)價(jià)T84細(xì)胞單層的通透性指標(biāo)。
　　 2.人肥大細(xì)胞系HMC-1、人單核細(xì)胞系THP-1、人中腎上皮細(xì)胞系HEK293吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)PGN的檢測(cè)
　　 T84細(xì)胞單層和HMC-1（THP-1、HEK293）共同培養(yǎng)于細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中，然后加入PGN至腸腔側(cè)中，2h后收集細(xì)胞。

5、細(xì)胞蛋白提取后用Western-Blot的方法檢測(cè)細(xì)胞中的PGN成分。一部分細(xì)胞用冷的丙酮固定后，用抗PGN單克隆抗體及熒光標(biāo)記的兔抗鼠Ⅱ抗孵育，共聚焦顯微鏡觀察。
　　 3.組織胺分析
　　 用ELISA試劑盒檢測(cè)MHC-1（THP-1、HEK293）、小鼠結(jié)腸粘膜肥大細(xì)胞及P815細(xì)胞（小鼠肥大細(xì)胞系）5-HT（5-羥色胺）和組織胺水平。
　　 4.已敲除HMC-1細(xì)胞中TLR2和NOD2的表達(dá)
　　

6、 RNAi技術(shù)用于檢測(cè)已敲除HMC-1細(xì)胞中TLR2和NOD2的表達(dá)。siRNA轉(zhuǎn)染的效果通過RT-PCR和Western-Blot的方法檢測(cè)。
　　 5. PGN誘發(fā)的鼠類腹瀉動(dòng)物模型
　　 用純化的PGN不同劑量溶于生理鹽水中灌胃，灌胃前用肥大細(xì)胞對(duì)抗物預(yù)處理。計(jì)算每只小鼠糞便中含水的百分比。記錄每只小鼠的小腸、大腸濕重及體重。小腸和大腸占體重的比率作為評(píng)估腸道液體的指標(biāo)。
　　 6.P815細(xì)胞TLR2、N

7、OD1的表達(dá)
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)、Western-Blot方法觀察P815細(xì)胞TLR2、NOD1的表達(dá)情況。
　　 7.免疫染色
　　 共聚焦顯微鏡觀察造型小鼠腸粘膜肥大細(xì)胞及P815細(xì)胞TLR2、NOD（1 or2）的表達(dá)。
　　 8.肥大細(xì)胞重建
　　 培養(yǎng)的肥大細(xì)胞（純度>95％）以30，000，40，000，和50，000個(gè)細(xì)胞/只的劑量通過尾靜脈注射到肥大細(xì)胞缺如小鼠（W/Wv）體內(nèi)1月

8、后用于重復(fù)口服PGN實(shí)驗(yàn)。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
　　 采用SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以X±SD表示，組間差異用t檢驗(yàn)檢測(cè)，三組及三組以上的組間比較用方差分析，P<0.05認(rèn)為差異具有顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1.把PGN加入細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)的腸腔側(cè)，把T84單層的TER（Transepithelial electric resistance，TER）和T84對(duì)HRP的通透性作為

9、檢測(cè)屏障功能的指標(biāo)。結(jié)果表明，只加PGN并不降低T84細(xì)胞單層的TER和通透性，與對(duì)照組相比沒有明顯差異。說明PGN并不直接破壞腸粘膜屏障。
　　 2.把融合的T84細(xì)胞和HMC-1共同培養(yǎng)在細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。在加入PGN到腸腔側(cè)2h后，培養(yǎng)基中組織胺的釋放量的增加呈劑量依賴性，電鏡結(jié)果表明肥大細(xì)胞廣泛脫顆粒。T84細(xì)胞單層的TER在PGN刺激后明顯降低，并且在肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑預(yù)處理后明顯得到抑制。由此證實(shí)T84細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的PGN

10、是通過激活HMC-1而完成的。
　　 3.為了證明TLR2介導(dǎo)PGN在肥大細(xì)胞中的吸收，把HMC-1培養(yǎng)在含有或不含有PGN的培養(yǎng)基中2h。然后收集并處理HMC-1細(xì)胞以證明TLR2表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示：TLR2在HMC-1細(xì)胞中的表達(dá)：0.28±0.06，在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)：0.29±0.1，在HEK293中沒有表達(dá)。用抗TLR2抗體頇處理的細(xì)胞上述過程受到抑制。Western-Blot、免疫細(xì)胞化學(xué)的方法同樣證明TLR2參與

11、肥大細(xì)胞吸收PGN。
　　 4. RT-PCR結(jié)果顯示在MHC-1細(xì)胞中檢測(cè)到NOD2 mRNA（0.28±0.08），THP-1：0.27±0.06，而在HEK293細(xì)胞中沒有檢測(cè)到NOD2 mRNA。經(jīng)預(yù)處理的HMC-1細(xì)胞釋放組織胺與對(duì)照組相比明顯受到抑制。結(jié)果顯示，PGN被吸收入細(xì)胞后與NOD2捆綁在一起從而激活MHC-1。
　　 5.用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法在共聚焦顯微鏡下觀察HMC-1，進(jìn)一步檢測(cè)PGN是否被吸收

12、到MHC-1細(xì)胞內(nèi)。結(jié)果表明，PGN被HMC-1和THP-1細(xì)胞吸收，并且呈劑量依賴性，PGN沒有在HEK293細(xì)胞中檢測(cè)到。
　　 6. HMC-1和T84細(xì)胞單層共同培養(yǎng)于細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。分別在腸腔側(cè)中加PGN和不加PGN。在基底膜側(cè)中加MHC-1和不加MHC-1。HRP流量及TER作為記錄上皮屏障功能的指標(biāo)。加入PGN組HRP的流量明顯增加，TER明顯降低，并呈劑量依賴性。用siRNA預(yù)處理TLR2和NOD2能抑制PG

13、N致T84細(xì)胞單層屏障的破壞。HRP回收率的增加及TEP的降低與HMC-1的
　　 數(shù)量呈平行關(guān)系。證實(shí)被激活的肥大細(xì)胞危及T84細(xì)胞單層的屏障功能。
　　 7. PGN溶于生理鹽水中以不同劑量給小鼠灌胃。腹瀉的嚴(yán)重程度與PGN呈劑量依賴性。結(jié)果表明PGN能夠誘導(dǎo)小鼠腹瀉。用PGN處理肥大細(xì)胞缺如小鼠（W/Wv）和肥大細(xì)胞正常同系小鼠（+/+），結(jié)果+/+小鼠出現(xiàn)腹瀉而W/Wv小鼠不出現(xiàn)腹瀉。結(jié)果表明，肥大細(xì)胞在PGN誘

14、導(dǎo)的腹瀉中起重要作用。
　　 8.用電子顯微鏡檢測(cè)肥大細(xì)胞脫顆粒，丟失顆粒成分或顆粒密度降低為脫顆粒表現(xiàn)。PGN處理的小鼠腸道組織肥大細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象非常明顯。PGN處理的小鼠肥大細(xì)胞脫顆粒的比率明顯增加，并呈劑量依賴性。用ELISA方法檢測(cè)PGN含量，與對(duì)照組相比PGN組，5-HT和組織胺水平明顯增高。用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑酮替酚處理和抗體對(duì)抗TLR2和NOD1明顯抑制5-HT和組織胺的釋放及肥大細(xì)胞脫顆粒。
　　 9.為了證

15、明PGN誘發(fā)肥大細(xì)胞激活的途徑，我們采用免疫印跡方法評(píng)估PGN對(duì)細(xì)胞質(zhì)IKB水平的影響。IKB水平的降低表明核因子IKB釋放及細(xì)胞核易位。用PGN處理P815細(xì)胞，Western Blot方法評(píng)估IKB-α，IKB-β磷酸化和非磷酸化表達(dá)，PGN能使IKB-α和IKB-β水平明顯降低，并且用抗-TLR2抗體和抗-NOD1抗體預(yù)處理能抑制上述過程。表明IKB-α和IKB-β參與來自于已易位于細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物的核因子IKB釋放。

16、　　 10.小鼠經(jīng)不同劑量肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑酮替酚預(yù)處理，然后PGN灌胃，腹瀉被預(yù)處理的酮替酚抑制，并呈酮替芬劑量依賴性。PGN灌胃引起腹瀉發(fā)生后，腹腔注射酮替酚仍能阻止腹瀉的發(fā)生?？菇M織胺和抗5-HT藥物協(xié)同作用能減弱PGN誘發(fā)的腹瀉。
　　 結(jié)論:
　　 1. PGN不直接改變?nèi)四c上皮細(xì)胞系T84細(xì)胞單層及小鼠腸上皮屏障功能；
　　 2. PGN激活HMC-1細(xì)胞造成T84細(xì)胞單層屏障功能減退；