傷害性神經(jīng)肽與肥大細胞在針刺穴位中的應答.pdf

1、穴位是針刺療法的作用點也是起效的的關鍵點，從《內(nèi)經(jīng)》定穴開始，醫(yī)家不斷研究穴位。從以前的穴位功能到六十年代的解剖結(jié)構(gòu)及組織結(jié)構(gòu)，到現(xiàn)代的穴位動態(tài)的網(wǎng)絡作用。從神經(jīng)、血管、組織液、肌肉、結(jié)締組織到細胞、因子，分子、神經(jīng)肽，到底穴位下什么物質(zhì)起到治病效果呢？這是研究者們一直關注的點，第一:穴位之間是否有共性，其共性來源于何處。第二:針刺刺激穴位后，在穴區(qū)所引起了什么樣的反應，使之針刺有療效，這是我們要解決的問題。
　　穴位的組織結(jié)構(gòu)與

2、細胞化學成份一直是針灸界所重視的，以往研究表明穴位解剖結(jié)構(gòu)并沒有特異性，故近年來研究者們把目光移向細胞化學成份和動態(tài)結(jié)構(gòu)。肥大細胞(mast cell，MC)作為一種普遍的免疫細胞，近年來備受關注。研究表明MC與經(jīng)絡現(xiàn)象密切相關，故可推斷MC在穴位中的作用也是不可忽視的，所以本研究以針刺穴位前后圍繞著MC來展開。MC作為一種免疫細胞在針灸過程中通過脫顆粒釋放出生物活性物質(zhì)參與機體的防御并發(fā)揮治療作用，但是與其相關的作用機制還不是很清楚，

3、尤其是對相關生物活性物質(zhì)研究的更少。為了更好地研究針刺穴位后局部組織相關細胞化學成分變化，我們主要以大鼠”百會”、”三陰交”、“合谷”穴區(qū)作為切入點，使用熒光組化與熒光免疫組化手段結(jié)合三維重建技術及激光共聚焦顯微成像，分別對非針刺和針刺后”百會”、”三陰交”、“合谷”穴區(qū)局部組織化學特征進行觀察對比，從形態(tài)學和生物化學兩方面解析穴位局部的組織細胞化學結(jié)構(gòu)隨針刺的改變，并在此基礎上采用三維觀察分析技術對穴位組織細胞化學結(jié)構(gòu)進行立體重建。通

4、過本研究我們不僅探討了針刺后穴位局部的組織細胞化學特征的變化，而且將為研究穴位結(jié)構(gòu)和功能提供新的技術手段，為穴位功能的動態(tài)研究奠定基礎。
　　目的:
　　1.運用熒光免疫組織化學技術、共聚焦技術、三維重建和系統(tǒng)分析的方法揭示不同穴位的組織細胞化學成份的比較。從小鼠“百會”“胃俞”“中脘”“合谷”等穴區(qū)入手觀察不同指標: MC、組織胺(Histamine，HA)、五羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)降鈣

5、素基因相關肽(Calcitonin gene relatedpeptide，CGRP)、香草醛亞型-1(transient receptor potential vanilloid type-1，TRPV1，VR1)和P物質(zhì)(Substance P，SP)。
　　2.運用熒光免疫組織化學技術、共聚焦技術、三維重建和系統(tǒng)分析的方法揭示針刺對穴區(qū)皮膚局部組織細胞化學成分的影響。主要從“合谷”“百會”“三陰交”穴區(qū)入手觀察針刺引起的不同

6、組織細胞化學成份的變化及相互關系。
　　方法:
　　以正常小鼠及大鼠為實驗對象，先剔除穴區(qū)毛，針刺一側(cè)穴位三分鐘捻轉(zhuǎn)出針，另一側(cè)作為對照。做完手法之后，將小鼠和大鼠用心臟灌流法使其組織固定，等充分固定后取材，取材部位為針刺部位的穴區(qū)皮膚組織及對側(cè)的與其對應的正常組織。取材完成后將組織放在含的4％多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH7.4)中2h到4h，進行后固定，之后清洗并移至含有25％蔗糖的的0.1 mol/L PB(

7、pH7.4)用于脫水至組織完全下沉。將脫水后的組織以恒冷箱切片機制成20μm的切片，隨后進行染色，染色方法如下:將組織切片分成5組:第一組用MC熒光免疫組織化學方法和鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)熒光組織化學方法染色，用于判斷MC和血管之間的關系以及針刺后MC的形態(tài)改變;第二組用MC結(jié)合5-HT免疫熒光組織化學方法觀察其共表達;第三組用MC結(jié)合HA免疫熒光組織化學方法觀察其共表達;第四組觀察MC和神經(jīng)纖維末梢SP表達;第五組觀察MC和

8、神經(jīng)纖維末梢CGRP的表達。
　　具體操作如下:1）先用組織化學筆把切片畫好圈使組織均包含其內(nèi)，注意避免接觸組織，然后用含3％山血清、0.1 mol/L PB(pH7.4)和0.5％ TritonⅩ-100的封閉液孵育0.5h;2）在第一組切片上加小鼠anti MC Tryptase抗體(1∶1000)，在第二組同時加小鼠anti MC Tryptase抗體(1∶1000)和兔anti5-HT Serotonin抗體(1∶1000

9、)，在第三組切片上同時加小鼠anti MC Tryptase抗體(1∶1000)和兔anti HASerotonin抗體(1∶1000)，在第四組切片上同時加小鼠anti MC Tryptase抗體(1∶1000)和兔anti SP神經(jīng)纖維抗體(1∶1000)，在第五組切片上同時加小鼠anti MC Tryptase抗體(1∶1000)和兔anti CGRP神經(jīng)纖維抗體(1∶1000)并放置于濕性盒中過夜，抗體的稀釋液中含1％山羊血清、

10、0.5％ TritonⅩ-100和0.1 mol/L PB(pH7.4);3)次日用0.1mol/L PB洗凈后，在第一組切片上同時加Alexa594熒光素化的山羊anti小鼠二次抗體(1∶500)和Alexa488熒光素化Phalloidin(1∶1000)，在第二組切片上同時加Alexa488熒光素化的山羊anti小鼠二次抗體(1∶500)和Alexa594熒光素化的山羊anti兔二次抗體(1∶500)，在第三組切片上同時加Alex

11、a488熒光素化的山羊anti小鼠二次抗體(1∶500)和Alexa594熒光素化的山羊anti兔二次抗體(1∶500)，在第四組切片上同時加Alexa488熒光素化的山羊anti小鼠二次抗體(1∶500)和Alexa594熒光素化的山羊anti兔二次抗體(1∶500)，在第五組切片上同時加Alexa488熒光素化的山羊anti小鼠二次抗體(1∶500)和Alexa594熒光素化的山羊anti兔二次抗體(1∶500)，在室溫下放置2h后

12、，稀釋液成分與上面用的相同;4）經(jīng)上面操作后的兩組組織切片用0.1 mol/L PB清洗3次后，再用核酸特異性熒光染料DAPI(1∶500000)復染，約6 min，再次清洗，然后以稀釋度(1∶1)的甘油溶液加蓋封片。從二抗開始實驗要求避光處理。
　　處理完成的組織切片用激光共聚焦成像系統(tǒng)記錄結(jié)果并拍攝留存。記錄圖像時設置和檢測指標免疫組化二抗時符合的光譜頻段，同時設置不同通道的亮度對比度等參數(shù)趨于統(tǒng)一。10X鏡下記錄的照片拍攝方

13、式為單層掃描，分辨率(AspectRatio)設為1024by，井深(CA)設為152μm;40X及以上倍數(shù)的照片記錄模式為多層掃描三維復合成像，(Aspect Ratio)設為640by，井深(CA)設為80μm，步進(StepSize)設為1.5μm，每張圖片依據(jù)指標表達情況復合10-15張重建復合形態(tài)。部分實驗圖片采用Imaris7.6.2軟件進一步三維重建、渲染編輯以及圖像分析。
　　結(jié)果:
　　1.不同穴位的組織細

14、胞化學成分比較:經(jīng)過正常小鼠“百會”“胃俞”“中脘”以及“合谷”等穴區(qū)局部皮膚組織中相關化學成分的對比分析，本研究發(fā)現(xiàn)Phalloidin標記的血管樣結(jié)構(gòu)、5-HT以及HA在各穴區(qū)均有表達，然而在各個穴區(qū)存在著量的差異。采用免疫雙標記法標記觀察了小鼠百會穴區(qū)5-HT和MC或者5-HT和HA的共表達，在正常百會穴區(qū)存在5-HT、HA和形態(tài)完整的MC，主要分布在真皮下，MC和HA均與5-HT共表達。同樣使用熒光免疫組織化學染色技術記錄了CG

15、RP和SP或者CGRP和VR1的雙標情況，于對照組的合谷穴皮下我們也觀察到了SP、VR1和CGRP陽性標記的神經(jīng)纖維位于皮下。另外可觀察到一些神經(jīng)纖維向表皮延伸的現(xiàn)象。
　　2.針刺引起穴區(qū)組織細胞化學成分的改變:采用免疫標記法標記觀察了”百會”、”三陰交”、“合谷”穴區(qū)5-HT、HA以及類胰蛋白酶(Tryptase)陽性表達的MC，在正常”百會”、”三陰交”、“合谷”穴位局部皮膚組織中同樣存在HA、5-HT以及靜息狀態(tài)下的MC，

16、經(jīng)過針刺干預，MC呈匯聚狀態(tài)分布并伴隨脫顆?，F(xiàn)象發(fā)生，脫出的樣物質(zhì)聚集在其周圍而且數(shù)量明顯增多，5-HT及HA數(shù)目增多聚集。在正常的合谷穴區(qū)有少量的SP和CGRP標記的陽性神經(jīng)纖維，針刺后這兩種神經(jīng)肽在神經(jīng)纖維的表達增加;正?！卑贂薄ⅰ比幗弧?、“合谷”穴區(qū)真皮下層和皮下組織中的血管周圍存在一定數(shù)量的MC，部分呈HA、5-HT陽性表達;針刺后，MC向針刺部位聚集伴有脫顆粒，胞體及其脫顆粒同時呈HA、5-HT陽性表達。
　　結(jié)論: