肥大細胞及其蛋白酶在藥物過敏性休克法醫(yī)診斷中的應用研究.pdf

1、目的：
　　測定藥物過敏性休克死亡者右心血、心包液、胸腔液及腹腔液中肥大細胞羧肽酶A3、類胰蛋白酶及類糜蛋白酶的含量；觀察類胰蛋白酶、類糜蛋白酶在藥物過敏性休克死亡者心、肺、咽喉、胃及空腸組織中的表達；試圖為藥物過敏性休克死亡的法醫(yī)學診斷提供客觀的實驗室診斷指標及檢測方法。
　　方法：
　　實驗設立藥物過敏性休克死亡組、冠心病猝死組及對照組三組。藥物過敏性休克死亡組20例，死因確診為藥物過敏性休克死亡，并排除其生前存在

2、冠心病、肥大細胞增多癥、顱腦損傷及吸食毒品；過敏性休克的原因分別為靜脈滴注青霉素2例、頭孢曲松鈉6例、左氧氟沙星5例、鹽酸林可霉素1例、賴氨匹林1例、洛美沙星1例、中藥清開靈1例，中藥雙黃連1例，口服布洛芬1例，水合氯醛灌腸1例；20例中5例在死后48h內進行了尸體解剖檢驗，14例在死后7d內進行了尸體解剖檢驗，1例在死后15d尸體解剖。冠心病猝死組20例，死因確診為冠狀動脈性猝死，并排除生前為過敏體質者、肥大細胞增多癥患者及毒品吸食者

3、，其中10例在死后48h內進行了尸體解剖檢驗，10例在死后7d內進行了尸體解剖檢驗。對照組20例，排除過敏性休克、顱腦損傷、冠心病及吸食毒品導致的死亡，并排除生前為過敏體質者及肥大細胞增多癥患者，20例均在死亡后48h內做了系統(tǒng)尸體解剖。
　　以上實驗組在進行尸體解剖檢驗時均采取尸體右心血、心包液、胸腔液和腹腔液，離心后取上清，-80℃冷凍保存，以備熒光酶聯(lián)免疫（FEIA）和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測；提取心臟、肺臟、咽喉、胃

4、及空腸組織，甲醛固定并石蠟包埋，以備進行免疫熒光染色；提取心臟、肺臟、咽喉、胃及空腸組織并進行蛋白提取,以備進行western blot檢測。
　　（1）ELISA雙抗體夾心法測定右心血、心包液、胸腔液及腹腔液中肥大細胞羧肽酶 A3和類糜蛋白酶的含量；（2）FEIA法測定右心血、心包液、胸腔液及腹腔液中肥大細胞類胰蛋白酶含量；（3）免疫熒光染色法對心、肺、咽喉、胃和空腸組織中類胰蛋白酶和類糜蛋白酶進行染色，Olympus BX61

5、熒光顯微鏡觀察并進行圖像采集， Image-pro plus6.2軟件進行圖像分析；（4）western blot法檢測心、肺、咽、胃和空腸器組織中類胰蛋白酶含量；（5）應用3種甲苯胺藍異染肥大細胞的方法，觀察藥物過敏性休克死亡組肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象；（6）SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA）進行檢驗，兩兩檢驗采用LSD法進行校正。
　　結果：
　　藥物過敏性休克死亡組右心血

6、、心包液、胸腔液及腹腔液肥大細胞羧肽酶A3含量分別為10.13±2.11ng/ml、4.34±1.61ng/ml、4.60±1.81ng/ml、4.49±1.21ng/ml，類胰蛋白酶含量分別為41.57±5.48ug/l、28.96±4.82ug/l、29.71±4.90ug/l、22.62±4.10ug/l，類糜蛋白酶含量分別為7.85±1.46ng/ml、7.31±1.37ng/ml、7.32±1.79ng/ml、7.29±1.5

7、3ng/ml。冠心病猝死組右心血、心包液、胸腔液及腹腔液肥大細胞羧肽酶A3含量分別為4.51±0.91ng/ml、2.07±0.41ng/ml、1.85±0.61ng/ml、1.89±0.66ng/ml，類胰蛋白酶含量分別為16.42±2.91ug/l、11.55±2.41ug/l、12.74±2.84ug/l、10.66±2.76ug/l，類糜蛋白酶含量分別為3.02±0.86ng/ml、2.80±0.67ng/ml、2.82±0.7

8、6ng/ml、2.79±0.76ng/ml。對照組右心血、心包液、胸腔液及腹腔液肥大細胞羧肽酶A3含量分別為3.18±1.30ng/ml、1.36±0.48ng/ml、1.26±0.36ng/ml、1.59±0.51ng/ml，類胰蛋白酶含量分別為4.86±0.86ug/l、4.64±0.95ug/l、3.30±0.84ug/l、3.11±0.96ug/l，類糜蛋白酶含量為1.22±0.55ng/ml、1.13±0.48ng/ml、1.

9、15±0.58ng/ml、1.11±0.49ng/ml。
　　藥物過敏性休克死亡組右心血、心包液、胸腔液及腹腔液中肥大細胞羧肽酶A3、類胰蛋白酶、類糜蛋白酶含量與冠心病猝死組及對照組相比，顯著升高（P<0.05），其中尤以右心血含量升高最為明顯；藥物過敏性休克死亡組心臟、肺臟、喉、胃及空腸組織組織中類胰蛋白酶及類糜蛋白酶表達均明顯高于冠心病猝死組及對照組（P<0.05）。
　　冠心病猝死組右心血及心包液肥大細胞羧肽酶 A3、

10、類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量與對照組相比顯著升高（ P<0.05），但其含量顯著低于藥物過敏性休克死亡組（P<0.05），胸腔液和腹腔液中肥大細胞羧肽酶A3、類胰蛋白酶、類糜蛋白酶與對照組相比，無明顯差異（P>0.05）；冠心病猝死組心臟組織中類胰蛋白酶及類糜蛋白酶表達明顯高于對照組（P<0.05），肺臟、喉、胃及空腸組織中類胰蛋白酶及類糜蛋白酶表達與對照組相比，無明顯差異（P>0.05）。
　　結論：
　?。?）FEIA法、

11、ELISA雙抗體夾心法測定尸體右心血、心包液、腹腔液及胸腔液中羧肽酶 A3、類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量，可作為藥物過敏性休克死亡法醫(yī)學鑒定的依據(jù)；（2）無法獲得心血、心包液、胸腔液及腹腔液或尸體腐敗的案例，western blot法、免疫熒光染色法檢測心臟、肺臟、喉、胃及空腸組織中類胰蛋白酶和類糜蛋白酶的表達，可應用于藥物過敏性休克死亡的法醫(yī)學鑒定。（3）藥物過敏性休克死亡者右心血、心包液、胸腔液及腹腔液中肥大細胞羧肽酶 A3、類胰蛋白

12、酶及類糜蛋白酶含量高低與其用藥后發(fā)敏時間、過敏后存活時間有關，且受死亡后保存條件及保存時間長短的影響；（4）藥物過敏性休克死亡者臟器組織中類胰蛋白酶及類糜蛋白酶表達多或少與用藥后發(fā)敏時間、過敏后存活時間及不同的靶向器官有關；與體液相比其受死亡后保存條件及保存時間長短的影響相對較小。（5）藥物過敏性休克死亡的機制復雜，加之鑒定過程中存在死后自溶、凝血及溶血，藥物過敏性休克死亡的實驗室診斷指標的準確性、靈敏度受到一定的影響，因此法醫(yī)學診斷非