簡(jiǎn)介：廣州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文從化市小兒呼吸道人類偏肺病毒感染的臨床與分子流行病學(xué)特征姓名陳能申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)指導(dǎo)教師周曉光20100501從化市小兒呼吸道人類偏肺病毒感染的臨床與分子流行病學(xué)特征3材料與方法（1）材料與方法（1）標(biāo)本收集收集2008年12月至2009年10月從化中心醫(yī)院6歲以下呼吸道感染住院患兒氣道分泌物標(biāo)本260例。（2）采用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（NESTEDPCR）檢測(cè)呼吸道分泌物HMPV感染，兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（HMPV1HMPV2）經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳后成像并存檔。（3）采用多重PCR（MULTIPLEPCR）檢測(cè)呼吸道合胞病毒A、B型（RSVARSVB），流感病毒甲、乙型（FLUAFLUB），副流感病毒1、2、3型（PIV1PIV2PIV3），PCR產(chǎn)物經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳后成像并存檔。（4）隨機(jī)挑選7例HMPV1陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司（INVITROGEN）完成。（5）所有測(cè)序結(jié)果與GENBANK中的序列進(jìn)行比對(duì)，分析同源性；多重序列比對(duì)采用CLUSTALW軟件；種系進(jìn)化分析采用DNASTAR軟件。結(jié)果（1）結(jié)果（1）HMPV1陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳后成像并存檔，陽性標(biāo)本和陽性對(duì)照于450BP～600BP間各出現(xiàn)一條目的條帶，與預(yù)期條帶大小一致（462BP）；HMPV2陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳后成像，陽性標(biāo)本和陽性對(duì)照于400BP～500BP間各出現(xiàn)一條目的條帶，與預(yù)期條帶大小一致（431BP）。（2）HMPV1男性陽性標(biāo)本17例，陽性率983；女性標(biāo)本4例，陽性率460。男、女感染陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ22132，P＞005）；HMPV2男性陽性標(biāo)本36例，陽性率2081；女性標(biāo)本12例，陽性率1379。男、女感染陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ22132，P＞005）。HMPV2男、女感染陽性率與HMPV1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ804P＜005Χ2441P＜005）。HMPV1發(fā)病年齡中年齡＜6個(gè)月組陽性率751；6個(gè)月＜年齡≦1歲組陽性率1311，兩個(gè)年齡組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HMPV2年齡＜6個(gè)月組陽性率1387；6個(gè)月＜年齡≦1歲組陽性率3115；1歲＜年齡≦3歲組陽性率2083。三個(gè)年齡組陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HMPV2發(fā)病年齡中1歲＜年齡≦3歲組陽性率與HMPV1比較有顯著性差異（Χ576P＜005）。HMPV感染3、4月份發(fā)病率較高，春季高發(fā)，發(fā)病高峰期與RSV感染有重疊。（3）HMPV1陽性標(biāo)本21例，陽性率為808；HMPV2陽性標(biāo)本48例，陽性率為1846。兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ5414P＜005）。HMPV感染臨床表現(xiàn)以咳嗽和喘息為主；HMPV1感染患兒喘息癥狀及中性粒細(xì)胞百分比與PIV3感染比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ24219，P＜005；T2424，P＜005）。HMPV2中性粒細(xì)胞百分比（N）與PIV3比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T226P＜005）。

簡(jiǎn)介：戊型肝炎HEPATITISE，HE是由戊型肝炎病毒HEPATITISEVIRUS，HEV感染引起的一種人畜共患病，主要暴發(fā)和流行于亞洲和非洲一些衛(wèi)生條件相對(duì)較差的發(fā)展中國(guó)家。人對(duì)HEV普遍易感，易感人群以大齡兒童和青壯年為主。在孕婦中可導(dǎo)致流產(chǎn)或引起死亡，病死率高達(dá)到15％～30％。2002～2004年衛(wèi)生部傳染病疫情報(bào)告顯示我國(guó)是戊型肝炎高發(fā)的國(guó)家，呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，HE已經(jīng)成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。越來越多的研究證據(jù)表明HEV可感染豬、犬、牛、山羊、綿羊、鹿、靈長(zhǎng)類、雞、貝類、嚙齒類等多種動(dòng)物，在這些動(dòng)物宿主中感染率最高是豬，而且從豬中分離到的病毒基因序列和人源毒株有較高的同源性。加之HEV與其它嗜肝性病毒相似，易降解、不穩(wěn)定，很難從糞便、膽汁等中分離到較大量的純HEV，缺乏合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，在很大程度上限制了HEV深入的研究。為了解昆明地區(qū)戊型肝炎流行情況和探索建立豬HEV感染動(dòng)物模型，我們開展了昆明地區(qū)人、豬、犬HE的血清流行病學(xué)調(diào)查，并以長(zhǎng)爪沙鼠和樹鼩建立豬HEV感染模型。本研究為進(jìn)一步研究豬HEV的感染機(jī)制、研制有效的防控手段奠定了基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下1昆明地區(qū)戊型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查研究。為了解昆明地區(qū)人、豬、犬戊型肝炎的血清流行病學(xué)特征，應(yīng)用雙夾心抗原ELISA對(duì)采集自昆明地區(qū)人血清樣品456份、豬血清樣品835份、犬血清樣品285份進(jìn)行HEVIGG抗體檢測(cè)。結(jié)果表明昆明地區(qū)人、豬、犬血清樣品中HEVIGG抗體陽性分別為4320％、5545％、2035％。人群中男性和女性HEVIGG抗體陽性率分別為4325％和4311％，男性和女性二者之間無顯著差異P＞00521～30歲4882％、31～40歲5086％、41～50歲4286％人群的HEV抗體陽性率顯著高于10～20歲2308％、51歲以上3289％人群P＜005。豬群中仔豬（1月齡～2月齡）、育肥豬（2月齡～6月齡）、種豬（6月齡以上）HEVIGG抗體陽性率分別為4685％、5706％、6542％。不同年齡組豬群抗HEVIGG陽性率存在差異且差異顯著P＜005。犬群中城市流浪犬、家庭散養(yǎng)犬和養(yǎng)殖場(chǎng)犬HEVIGG抗體陽性率分別為5918％、1316％和1071％，家庭散養(yǎng)犬、養(yǎng)殖場(chǎng)犬HEV與流浪犬HEVIGG抗體陽性率差異顯著P＜005。德國(guó)牧羊犬、昆明犬與雪橇犬、其他品種之間及雪橇犬與其他品種之間HEVIGG抗體陽性率顯著差異P＜005。1歲以下與1～5歲、5～10歲、10歲以上犬HEVIGG抗體陽性率顯著差異P＜005。研究表明昆明地區(qū)人、豬、犬中存在戊型肝炎的流行，人群、豬群和犬HEVIGG陽性率與年齡有關(guān)，21～50歲人群HEVIGG抗體陽性率相對(duì)10～20歲、51歲以上較高豬群HEVIGG陽性率隨年齡的增長(zhǎng)而逐步升高犬HEVIGG抗體陽性率隨年齡的增長(zhǎng)而逐步下降。2昆明及周邊縣豬戊型肝炎病毒分子流行病學(xué)調(diào)查研究。為了解昆明地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)中仔豬HEV的分子背景和流行特征，針對(duì)GENBANK中HEV的F2保守區(qū)域序列，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)巢式PCR引物。分別對(duì)采集自昆明及周邊縣的187份仔豬糞便樣品進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增出348BP左右的片段為陽性，陽性率為695％。祿勸縣、江川縣、富民縣陽性率分別為454％、800％、952％。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行核苷酸同源性比較和遺傳進(jìn)化分析，9株豬HEV348BP擴(kuò)增片段的核苷酸同源性為871％～994％，與HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ型同源性分別為770％～819％、522％～536％、770％～882％，與HEVⅣ型的同源性為779％～968％。通過遺傳進(jìn)化樹分析得出所檢測(cè)到的9株豬HEV毒株均為HEV基因Ⅳ型。研究表明昆明地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)中仔豬群中存在HEV感染并且都為基因Ⅳ型。3戊型肝炎病毒感染豬肝臟的組織病理學(xué)觀察。為了解豬戊型肝炎病毒感染肝的組織病理學(xué)變化，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和蘇木素伊紅染色對(duì)采集自昆明地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上的待售豬肝樣品176份進(jìn)行了組織病理學(xué)觀察。免疫組織化學(xué)染色觀察得出，市售豬肝呈HEV抗原陽性率為6534％。蘇木素伊紅染色觀察得出，5130％的豬肝組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，2870％的豬肝組織出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生，2087％的豬肝出現(xiàn)肝細(xì)胞萎縮，1913％的豬肝出現(xiàn)肝細(xì)胞變性、壞死。研究表明昆明地區(qū)市售豬肝中普遍存在HEV感染并出現(xiàn)相應(yīng)的病理學(xué)變化。4豬戊型肝炎病毒感染長(zhǎng)爪沙鼠的實(shí)驗(yàn)研究。為了探討建立豬戊型肝炎病毒感染長(zhǎng)爪沙鼠模型的可能性，應(yīng)用HEV陽性豬糞便上清液腹腔注射接種長(zhǎng)爪沙鼠，定期檢測(cè)長(zhǎng)爪沙鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST水平的變化及肝臟、糞便、血液、小腸中HEVRNA的產(chǎn)生，病理組織學(xué)變化及HEV在肝臟中的分布情況。結(jié)果表明長(zhǎng)爪沙鼠接種豬HEV后7天血清中ALT和AST均同步上升，此后開始降低。但ALT值到接種后35天還是沒有降低到對(duì)照組水平，攻毒組比陰性對(duì)照組數(shù)值高出2倍左右。AST到接種后35天基本回落到正常范圍內(nèi)（根據(jù)陰性對(duì)照）。糞便和肝臟中均能檢測(cè)到HEVRNA，血液和小腸偶能檢測(cè)HEVRNA。肝臟組織觀察到肝小葉間淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞顆粒變性，局灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞索排列紊亂、膽管增生等。后期表現(xiàn)為多發(fā)性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞壞死，枯否細(xì)胞增多，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生。小腸、腎、腦、脾臟等組織也有不同程度病理變化。免疫組化檢測(cè)結(jié)果可見到肝細(xì)胞漿中有強(qiáng)陽性信號(hào)。說明成功建立了豬戊型肝炎病毒感染長(zhǎng)爪沙鼠模型。5豬戊型肝炎病毒感染樹鼩的實(shí)驗(yàn)研究。為了探討建立豬戊型肝炎病毒感染樹鼩模型的可能性，應(yīng)用HEVRNA陽性豬糞便上清液腹腔注射接種樹鼩，定期檢測(cè)樹鼩血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST水平的變化及肝臟、糞便、血液、小腸、腎臟、脾臟中HEVRNA的產(chǎn)生，病理組織學(xué)變化。結(jié)果表明樹鼩接種豬HEV后7天血清中ALT和AST均同步升高，此后開始降低。但ALT和AST到接種第28天還是沒有降低到對(duì)照組水平，攻毒組比陰性對(duì)照組數(shù)值高。樹鼩接種豬HEV7天后肝臟、糞便、血液、小腸中能檢測(cè)到HEVRNA，腎臟和脾臟中偶能檢測(cè)HEVRNA。肝臟可觀察到靜脈竇淤血、肝細(xì)胞空泡變性、多發(fā)性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、枯否細(xì)胞增多、匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生等病變。小腸、腎等組織也有不同程度病理變化。說明建立豬戊型肝炎病毒感染樹鼩模型是可行的，可為進(jìn)一步研究HEV跨物種傳播和致病機(jī)制等奠定基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：目的本研究通過對(duì)2009～2014年福建省甲型H1N1流感（甲流）病毒的分子流行病學(xué)特征進(jìn)行分析，結(jié)合本省流感的監(jiān)測(cè)情況，旨在探索該病毒在我省的基因變異和分子特征，掌握流感流行的趨勢(shì)，為預(yù)測(cè)疫苗的防治效果及防控甲流疫情提供科學(xué)依據(jù)。方法收集106株源自福建省各哨點(diǎn)醫(yī)院流感樣病例的甲流病毒毒株，通過RTPCR和測(cè)序方法獲得HA和NA基因的全長(zhǎng)序列。運(yùn)用分子生物學(xué)軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接、比對(duì)和分析，以甲流病毒疫苗株ACALIFNIA072009H1N1為參考毒株，從多個(gè)方面對(duì)我省甲流的分子流行病學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)合流感監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)來揭示甲流在我省的流行規(guī)律和變異特征。結(jié)果1、2009～2014年福建省甲流經(jīng)歷了流行消長(zhǎng)的反復(fù)過程，近兩年的流行強(qiáng)度更是加大，2014年下半年處于流行低谷，但很有可能迎來新的流行高峰。2、同源進(jìn)化分析顯示，福建省甲流病毒HA基因與疫苗株的核苷酸和氨基酸的同源性分別在976％～996和972～991之間；NA基因則分別在987～996和974～996之間。隨著時(shí)間的推移，HA基因和NA基因的進(jìn)化樹均逐漸形成6個(gè)分支，HA蛋白上的S143G、H138R、V249L、V234I、K163Q、S185T、S451N和NA蛋白上的K432E、V241I發(fā)生突變可能是導(dǎo)致毒株聚集成不同分枝的重要原因，其中H138R和S143G分別位于抗原決定簇CA上和其周圍，K163Q和S185T則分別位于抗原決定簇SA和SB上。3、抗原性分析顯示，2009～2014年期間福建省甲流病毒HA蛋白中共有97個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變化，其中有17個(gè)氨基酸位點(diǎn)，變異累計(jì)涉及4個(gè)抗原決定簇，也有部分毒株在190螺旋和220環(huán)上位點(diǎn)發(fā)生變異，從2012年開始，毒株相對(duì)疫苗株出現(xiàn)了較大的變異，氨基酸位點(diǎn)的變異個(gè)數(shù)均超過10個(gè)。福建省近年來的甲流毒株已經(jīng)出現(xiàn)了抗原漂移現(xiàn)象。抗原漂移株與非抗原漂移株在NA基因第34、44、200、241、321、369、386和432位點(diǎn)上的變異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4、在本次甲流毒株中發(fā)現(xiàn)了D222G和Q293H位點(diǎn)的突變，但并未增強(qiáng)病毒毒力，所有毒株均表現(xiàn)為低致病性。5、本次研究中發(fā)現(xiàn)了“達(dá)菲”耐藥位點(diǎn)H275Y，并伴有可能會(huì)增強(qiáng)H275Y突變株NA酶活性及蛋白表達(dá)的V241I和N369K的同時(shí)突變。6、有3個(gè)毒株的HA蛋白上均增加一個(gè)位于抗原決定簇SA內(nèi)的糖基化位點(diǎn)NKS162164或NQS162164，其中2個(gè)毒株源于暴發(fā)疫情。在毒株中發(fā)現(xiàn)可能與耐藥相關(guān)的NA上的糖基化位點(diǎn)NQS4244的增加，在毒株AFUJIANFUZHOUSWL117242009H1N1上也發(fā)現(xiàn)了可能會(huì)影響病毒的組織嗜性尤其是神經(jīng)嗜性的NA蛋白的NGT146148位點(diǎn)的缺失。結(jié)論福建省甲流病毒已悄然發(fā)生遺傳變異和分子進(jìn)化，與疫苗的同源性隨著時(shí)間的推移逐漸降低，并出現(xiàn)了51株抗原漂移株，且在NA基因上發(fā)現(xiàn)8個(gè)可能與抗原漂移現(xiàn)象相關(guān)的位點(diǎn)和H275Y耐藥位點(diǎn)。未來福建省可能會(huì)迎來新一輪甲流的流行。

簡(jiǎn)介：人腺病毒HUMANADENOVIRUS，HADV是一類無包膜的雙鏈DNA病毒，分為A～G7個(gè)血清學(xué)組，包括56個(gè)血清型。HADV經(jīng)呼吸道和消化道傳播，可引起人多種器官感染，對(duì)小兒和免疫缺陷者危害尤為嚴(yán)重。HADV感染人體可引發(fā)急性腺病毒型肺炎、急性胃腸炎、眼角膜炎、乳糜瀉和急性間質(zhì)性腎炎等多種疾病。其中HADVB組感染目前已成為急性呼吸系統(tǒng)疾病ACUTERESPIRATYDISEASE，ARD的重要因素。超過5％的急性呼吸道傳染病為HADV感染所致，特別是在急性下呼吸道感染兒童患者中HADV感染陽性率最高可達(dá)373％。近年來，B2亞組中出現(xiàn)的新型HADVB55在成人特別是學(xué)校和軍隊(duì)特殊人群中引起日益頻繁的急性呼吸道傳染病流行。我國(guó)2009年首次報(bào)道了HADVB55疫情，導(dǎo)致247名師生及市民發(fā)病，1名學(xué)生死亡。考慮到HADV并未列入我國(guó)傳染病監(jiān)控病原，現(xiàn)有報(bào)道的HADV疫情大多未鑒定型別，因此HADVB55在我國(guó)引起的成人急性呼吸道傳染病流行可能遠(yuǎn)高于實(shí)際報(bào)道病例，其潛在威脅不容忽視。由于抗原性上與HADVB11的聯(lián)系和差異，HADVB55早期被命名為HADVB11A。經(jīng)全基因組序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析，HADVB55實(shí)際為HADVB11和14的HEXON基因重組突變體。HADVB55作為一個(gè)新近受到關(guān)注的呼吸道感染類腺病毒，基因組及生物學(xué)特征均未明確。傳統(tǒng)的HADVB11主要導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)的感染，HADVB14和55則主要引起呼吸系統(tǒng)感染。因此，明確HADVB55的基因組及生物學(xué)特征，闡明重組HADVB55與其親本病毒的聯(lián)系及差異，以及進(jìn)一步探討呼吸道HADV重組與其致病性上的聯(lián)系，將可加深對(duì)呼吸道HADV病原學(xué)的認(rèn)識(shí)，并為進(jìn)一步研究其重組與致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本項(xiàng)研究從HADV感染咽拭子樣本中，利用敏感細(xì)胞系分離獲得了HADVB55病毒株，完成了病原學(xué)鑒定，對(duì)其基因組特征及其進(jìn)化重組進(jìn)行了分析，并進(jìn)一步針對(duì)病毒重組，對(duì)HADVB55與親本病毒11和14型在生物學(xué)特征上的差異進(jìn)行了系統(tǒng)比較，明確了HADVB55型重組后生物特征學(xué)上的改變，并初步探討了HADV重組對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響及其與致病性之間的聯(lián)系。一、新型HADVB55的分離與鑒定我們自2011年山西HADVB55疫情中，從臨床咽拭子樣本中分離獲得了HADVB55毒株Y16SX2011簡(jiǎn)稱Y16。該毒株可感染呼吸道細(xì)胞系A(chǔ)549及HEP2，并引起明顯的細(xì)胞病變，A549細(xì)胞在感染24小時(shí)后即可觀察到細(xì)胞腫脹及圓縮等病變現(xiàn)象，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，在感染48小時(shí)后細(xì)胞逐步出現(xiàn)了類似拉網(wǎng)樣空泡，而在感染5天后可導(dǎo)致細(xì)胞完全圓縮、脫落、融解。分離株可在A549細(xì)胞上有效增殖，病毒滴度最高可達(dá)245108PFUML，并形成大小均一的噬斑形態(tài)。在電鏡下觀察HADVB55型病毒顆粒，HADVB55型具有與其他HADV相似的電鏡形態(tài)，呈現(xiàn)典型的二十面體形態(tài)。在感染細(xì)胞后，細(xì)胞顆粒主要集中于細(xì)胞核內(nèi)，呈晶格狀排列。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示Y16分離株無法感染小鼠和增殖，僅可引起非特異的病理性損傷。上述分離株病原學(xué)特征的初步鑒定，為進(jìn)一步開展HADVB55型基因組分析、致病機(jī)制及疫苗的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。二、HADVB55分離株基因組特征與進(jìn)化重組分析為了進(jìn)一步分析Y16分離株的基因組及進(jìn)化特征，我們對(duì)其全長(zhǎng)基因進(jìn)行了序列測(cè)定和基因組標(biāo)注，并進(jìn)一步以GENBANK公布的HADVB組序列為依據(jù)，進(jìn)行了進(jìn)化分析?；谌蚪M序列的進(jìn)化關(guān)系顯示Y16分離株屬于HADVB2亞組。序列同源性分析表明Y16株與我國(guó)2006年山西的QSDLL分離株相似度高，僅有8個(gè)核苷酸上的差異與HADVB11的同源性為976％，而與HADVB14的同源性為989％。進(jìn)一步對(duì)Y16主要表面衣殼蛋白HEXON、FIBER、PENTON及E1A蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示分離株的HEXON與HADVB11型同源性較14型高為974％，與HADVB14型的同源性僅為925％但其他幾個(gè)蛋白如FIBER、PENTON及E1A蛋白與HADVB14型的同源性均高于99％，顯著高于分離株與HADVB11型的同源性。對(duì)分離株的進(jìn)化關(guān)系分析同樣證實(shí)了上述結(jié)果，基于編碼蛋白HEXON、FIBER、PENTON及E1A基因的進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，Y16的HEXON基因進(jìn)化關(guān)系與HADVB11相近，而FIBER、PENTON及E1A基因及進(jìn)化關(guān)系均與HADVB14型屬同一進(jìn)行分支。進(jìn)一步對(duì)Y16毒株進(jìn)行重組分析，發(fā)現(xiàn)本次分離到的Y16株為HADVB11型的HEXON蛋白和14型重組后的新型HADV，其重組區(qū)為1869519587位核苷酸區(qū)，其重組特征與之前文獻(xiàn)報(bào)道一致。這些結(jié)果明確了我國(guó)HADVB55型的基因組及其變異情況，為HADV流行分析與溯源，疫苗研制及制訂疾病防控策略等提供理論依據(jù)。三、HADVB55與重組親本病毒HADV1114的病原學(xué)比較研究為了明確HADV重組對(duì)HADVB55生物學(xué)特征和致病性的影響，我們系統(tǒng)比較了重組Y16分離株與其親本病毒HADVB11和14型細(xì)胞組織嗜性和體外生物學(xué)特征、不同溫度環(huán)境中在細(xì)胞內(nèi)的病毒增殖能力、蝕斑形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、熱穩(wěn)定性、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡、細(xì)胞吸附能力和干擾素的動(dòng)態(tài)變化等方面的差異。研究結(jié)果顯示，HADVB55具有與HADVB11和14類似的一些生物學(xué)特征。三個(gè)型別的腺病毒均具有廣譜細(xì)胞嗜性，在不同組織來源的細(xì)胞系內(nèi)均可以實(shí)現(xiàn)有效的增殖在A549細(xì)胞上均可形成典型的蝕斑形態(tài)。此外，三個(gè)型別HADV也可抑制細(xì)胞內(nèi)干擾素的產(chǎn)生。電鏡下未發(fā)現(xiàn)形態(tài)存在顯著差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HADVB55與HADVB11和14體外致病性存在一些顯著差異。HADVB55在A549、RD、HEP2、HEPG2、HEK293和HELA等六類細(xì)胞系內(nèi)致病變能力、細(xì)胞毒性以及致細(xì)胞凋亡能力均明顯弱于親本病毒11及14型上述特征將有利于病毒在細(xì)胞中的持續(xù)增殖。在模擬上呼吸道環(huán)境中，HADVB55增殖與HADVB14接近，但均快于HADVB11在下呼吸道模擬環(huán)境中，HADVB55的增殖顯著快于HADVB11和14，且在A549細(xì)胞上的蝕斑形態(tài)顯著大于親本病毒HADVB11和14型。在熱穩(wěn)定性比較分析中，我們發(fā)現(xiàn)HADVB55型在37℃時(shí)的熱穩(wěn)定性明顯弱于親本病毒11和14型的穩(wěn)定性。上述結(jié)果提示基因重組與氨基酸突變?cè)贖ADVB55型致病機(jī)制中的重要作用，HADV衣殼蛋白HEXON的重組，可能與HADV的復(fù)制能力及熱穩(wěn)定性存在著聯(lián)系。本部分的研究結(jié)果為下一步揭示基因重組與HADV毒力變異的關(guān)聯(lián)這一科學(xué)問題，為深入探索和闡明不同HADV致病機(jī)制與流行特征奠定了基礎(chǔ)。四、HADV55快速檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)為滿足HADVB55快速檢測(cè)篩查的需要，我們分別建立了環(huán)介導(dǎo)等溫快速檢測(cè)方法、實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法和區(qū)分HADVB111455的多重PCR檢測(cè)方法等。這些方法具有較好的敏感性和特異性。其中HADVB55特異LAMP檢測(cè)方法，靈敏度與實(shí)時(shí)定量PCR相當(dāng)，均可以檢測(cè)到0008PFU反應(yīng)同時(shí)，該方法還可無須提取核酸過程直接對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，極大方便了對(duì)HADV感染的甄別。我們將上述建立的三種快速檢測(cè)方法應(yīng)用到臨床樣本的檢測(cè)中。實(shí)驗(yàn)證明三種方法均具有良好的特異性和靈敏度，可適應(yīng)在不同環(huán)境中HADVB55檢測(cè)及鑒定，可為臨床及基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)野外提供快速準(zhǔn)確的診斷信息。本研究成功對(duì)人腺病毒55型Y16SX2011株進(jìn)行了分離與鑒定，并完成全基因組序列測(cè)定與分析，明確了其與我國(guó)QSDLL腺病毒55型分離株的8個(gè)核苷酸差異及其進(jìn)化特征，重組分析顯示分離株為HADVB11和14型的重組產(chǎn)物。進(jìn)一步的病原學(xué)比較研究顯示，HADVB55分離株在細(xì)胞嗜性，呼吸道細(xì)胞系上的增殖能力均強(qiáng)于親本病毒11和14型，而細(xì)胞毒性及致細(xì)胞凋亡能力則弱于親本株。本研究對(duì)HADVB55基因組特征與生物學(xué)特征的闡明，以及與其重組親本的病原學(xué)比較，為深入研究腺病毒進(jìn)化重組機(jī)制及其對(duì)病毒致病性的影響奠定了基礎(chǔ)，并為腺病毒的防控及疫苗的研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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簡(jiǎn)介：手足口病是一類主要由小RNA病毒科腸道病毒屬病毒引起的傳染病主要感染對(duì)象是嬰幼兒ENTEROVIRUS71EV71與COXSACKIEVIRUSA16CVA16是引起手足口病的兩個(gè)最主要病原體。在2009年1月至2011年5月期間我國(guó)發(fā)現(xiàn)的由EV71流行引起的感染病例超過了200萬其中約有1000人死亡。并且EV71的感染者常常會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)疾病而CVA16導(dǎo)致的手足口病則不會(huì)有嚴(yán)重的并發(fā)癥。所以針對(duì)EV71的研究備受人們關(guān)注。EV71病毒為單股正鏈RNA病毒基因組約有75KB。該基因組編碼一個(gè)約250KDA的多聚蛋白這個(gè)多聚蛋白被自身產(chǎn)生的2A蛋白酶2APRO和3C蛋白酶3CPRO切割產(chǎn)生11個(gè)成熟的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中以RNA為模板的RNA聚合酶RNADEPENDENTRNAPOLYMERASERDRP即水解后所產(chǎn)生的3DPOL主要負(fù)責(zé)病毒的復(fù)制是抗病毒藥物設(shè)計(jì)的主要靶點(diǎn)之一。解析出3DPOL的結(jié)構(gòu)再根據(jù)結(jié)構(gòu)特征篩選出特異性的抑制劑對(duì)防治手足口病具有重要意義。我們將3DPOL構(gòu)建在了實(shí)驗(yàn)室改造的含有TEV蛋白酶酶切位點(diǎn)的PGEX4T1上來表達(dá)蛋白并通過GST親和層析、離子交換和分子篩純化獲得了較純的蛋白。在篩選了大約1800個(gè)結(jié)晶條件并對(duì)有效條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化后獲得了衍射結(jié)果較好的蛋白晶體。通過在上海同步輻射光源SSRF的衍射實(shí)驗(yàn)我們獲得的3DPOKL分辨率達(dá)到了24A。這對(duì)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)篩選抗EV71藥物具有重要意義。

簡(jiǎn)介：碩士學(xué)位論文上海地區(qū)兒童流感病毒的分子流行病學(xué)研究姓學(xué)導(dǎo)名科師導(dǎo)師小組成員蔡潔皓兒內(nèi)科學(xué)感染病學(xué)曾玫教授王曉紅教授楊麗華主任技師王中林副教授20種氨基酸中英文縮寫對(duì)照中文名稱英文名稱三字縮寫單字縮寫甘氨酸GLYCINEGLYG丙氨酸ALANINEALAA纈氨酸VALINEVALV亮氨酸LEUCINELEUL異亮氨酸ISOLEUCINEILEI脯氨酸PROLINEPROP苯丙氨酸PHENYLALANINEPHEF酪氨酸TYROSINETYRY色氨酸TRYPTOPHANTRPW絲氨酸SERINESERS蘇氨酸THREONINETHRT半胱氨酸CYSTINECYSC蛋氨酸METHIONINEMETM天冬酰胺ASPARAGINEASNN谷氨酰胺GLUTARNINEGLNQ天冬氨酸ASPARTICACIDASPD谷氨酸GLUTAMICACIDGLUE賴氨酸LYSINELYSK精氨酸ARGININEARGR組氨酸HISTIDINEHISH

簡(jiǎn)介：分類號(hào)分類號(hào)R73371學(xué)校代碼學(xué)校代碼10392學(xué)科專業(yè)代碼學(xué)科專業(yè)代碼100201學(xué)號(hào)號(hào)200901218福建醫(yī)科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文慢病毒介導(dǎo)的慢病毒介導(dǎo)的BMI1基因沉默對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)基因沉默對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)特性及硼替佐米敏感性特性及硼替佐米敏感性影響的研究影響的研究STUDYONSILENCEOFBMI1MEDIATEDBYLENTIVIRUSSHRNAONBIOLOGICALACTERSSENSITIVITYTOBTEZOMIBINMULTIPLEMYELOMACELLS學(xué)位類型學(xué)位類型醫(yī)學(xué)碩士所在學(xué)院院協(xié)和臨床醫(yī)學(xué)院協(xié)和臨床醫(yī)學(xué)院研究生生徐珍珍徐珍珍學(xué)科、專業(yè)學(xué)科、專業(yè)內(nèi)科學(xué)內(nèi)科學(xué)血液血液導(dǎo)師師戰(zhàn)榕戰(zhàn)榕教授教授研究起止日期研究起止日期2010年12月至月至2012年3月答辯日期答辯日期2012年6月6日二〇一二年一二年六月目錄英文略縮詞英文略縮詞2中文摘要中文摘要3英文摘要英文摘要5前言前言7第一部分第一部分BMI1SHRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)骨髓瘤細(xì)胞株的建立慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)骨髓瘤細(xì)胞株的建立引言9材料和方法10結(jié)果19討論21結(jié)論24第二部分第二部分BMI1基因沉默對(duì)基因沉默對(duì)骨髓瘤骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)特性及增強(qiáng)細(xì)胞生物學(xué)特性及增強(qiáng)骨髓瘤骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞對(duì)硼替佐米敏感性替佐米敏感性的機(jī)制機(jī)制研究研究引言25材料和方法26結(jié)果29討論39結(jié)論42全文總結(jié)全文總結(jié)43參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)44致謝致謝50綜述綜述BMI1基因在多發(fā)性骨髓瘤中的研究進(jìn)展基因在多發(fā)性骨髓瘤中的研究進(jìn)展51

簡(jiǎn)介：原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HEPATOCELLULARCARCINOMA，HCC）是世界范圍內(nèi)惡性腫瘤中發(fā)病率居第五、致死率居第三的惡性疾病。每年全世界約有700，000例新增患者，其中男性發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性，且主要集中于東南亞地區(qū)以及非洲撒哈拉沙漠以南區(qū)域，呈現(xiàn)顯著的地域性分布。中國(guó)大陸地區(qū)HCC患者數(shù)量占全世界患者數(shù)量的50％，其中男性發(fā)病率為352100，000，女性發(fā)病率為133100，000。病因?qū)W統(tǒng)計(jì)顯示54％的HCC患者與乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV感染關(guān)系密切。雖然HBV疫苗的強(qiáng)制接種使目前中國(guó)HBV病毒感染者數(shù)量由975％降到718％，但由于人口基數(shù)龐大以及已有感染者發(fā)生HCC的滯后效應(yīng)等因素的影響，HBV患者的治療和預(yù)防依然是中國(guó)社會(huì)亟待解決的公共衛(wèi)生安全問題。HBV基因編碼四種蛋白，包括表面抗原HBSAG、核心區(qū)蛋白HBEAG和HBCAG、病毒DNA聚合酶HBP以及HBX。其中HBX是一種多功能的病毒調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞癌的功能。近年來通過酵母雙雜交、染色質(zhì)免疫共沉淀、表達(dá)譜芯片分析以及蛋白質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBX主要參與調(diào)節(jié)病毒與宿主細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和蛋白質(zhì)降解水平等多個(gè)生物學(xué)過程，進(jìn)一步證實(shí)了HBX基因功能的復(fù)雜性和多樣性。盡管在HBX基因功能研究中取得較大成績(jī)，但是在研究的策略、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约澳Ｐ偷募膊顟B(tài)方面存在諸多不足。主要體現(xiàn)為研究策略局限于局部的信號(hào)或代謝通路，缺乏系統(tǒng)性、整體性的分析，或者僅有基因MRNA水平的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，缺少蛋白質(zhì)水平的系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投嘁曰颊呓M織樣本或體外培養(yǎng)的細(xì)胞系為主，忽視了細(xì)胞微環(huán)境和遺傳異質(zhì)性等要素對(duì)于HBX致病機(jī)制研究的干擾。此外，HBX引發(fā)的從肝臟炎癥并發(fā)展至癌癥的進(jìn)程中的作用機(jī)制并沒有得到清晰的闡釋。本研究旨在利用高覆蓋、高精度的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索HBX誘發(fā)小鼠肝臟炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化的病理生理學(xué)機(jī)制。研究依托HBX轉(zhuǎn)基因致肝癌小鼠模型，選擇分別代表HBX誘發(fā)的肝臟炎癥與癌癥病理狀態(tài)的12個(gè)月12M和24個(gè)月24M的組織作為實(shí)驗(yàn)材料，以HBX轉(zhuǎn)基因小鼠的同窩正常小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，以避免遺傳背景和外界環(huán)境對(duì)HBX基因功能研究的干擾。選用實(shí)驗(yàn)室制備的重穩(wěn)定性同位素標(biāo)記氨基酸完全標(biāo)記的小鼠作為定量?jī)?nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)高精度蛋白質(zhì)組定量。同時(shí)，通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選與HBX發(fā)生相互作用的關(guān)鍵分子。以“與HBX相互作用蛋白”為中心點(diǎn)結(jié)合定量蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，重構(gòu)“HBX結(jié)合蛋白信號(hào)效應(yīng)”的HBX網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。本研究在國(guó)內(nèi)首次發(fā)展了用于小鼠模型的SILAC整體標(biāo)記方法。利用含有重穩(wěn)定性同位素標(biāo)記賴氨酸13C6LYSINE的SILAC鼠糧飼養(yǎng)C57BL6小鼠，實(shí)現(xiàn)代謝過程中的小鼠蛋白質(zhì)組高標(biāo)記。對(duì)不同器官組織樣品進(jìn)行標(biāo)記效率的LCMSMS定量分析，證明F2代小鼠的整體標(biāo)記效率達(dá)到95％以上。其中用于HBX小鼠實(shí)驗(yàn)中的F2代SILAC小鼠肝臟標(biāo)記效率達(dá)到9634％±090％，這為高精度定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究創(chuàng)造了條件。在蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究中，我們共鑒定到162個(gè)與HBX相互作用的蛋白。GO分析顯示這些蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞骨架重構(gòu)、線粒體組份、脂代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和RNA可變剪接等諸多過程。其中47個(gè)已經(jīng)被以前的研究證實(shí)，占鑒定的162個(gè)相互作用蛋白的近30％，顯示了蛋白質(zhì)組學(xué)在研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用中的可行性。剩余的115個(gè)蛋白質(zhì)為首次鑒定的和HBX相互作用的蛋白質(zhì)，體現(xiàn)了我們蛋白質(zhì)組檢測(cè)平臺(tái)的靈敏度和高覆蓋蛋白質(zhì)組技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。在這162個(gè)HBX相互作用蛋白中，最大的群體是細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白。共有37個(gè)蛋白質(zhì)屬于這個(gè)類群，包括肌凝蛋白MYL6B、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白ACTR3B、連環(huán)蛋白ΒCATENIN、驅(qū)動(dòng)蛋白KIF11和KIF5C、血管抑素結(jié)合蛋白AMOT、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白SVIL等。這些蛋白可通過復(fù)雜的相互作用促進(jìn)細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞遷移、管狀結(jié)構(gòu)的形成以及偽足的數(shù)量等，并進(jìn)而影響血管生成。第二大蛋白質(zhì)類群是與線粒體功能活動(dòng)關(guān)系密切的相互作用蛋白，共32個(gè)，包括谷氨酰胺環(huán)化酶ΓGGCT、脫氧尿苷三磷酸酶DUT、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶APRT、CA2的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族分子CAMK2D等。這些蛋白質(zhì)參與核酸和氨基酸代謝、RNA可變剪接等生物學(xué)過程。特別值得關(guān)注的是HBX不僅可與Β脂肪酸氧化進(jìn)程中的脂肪酰輔酶A合成酶ACSF2和脂肪羥酰輔酶A脫氫酶家族成員HADH等2個(gè)限速酶發(fā)生相互作用，而且還與酯酶分子甾醇載體蛋白SCP2、胰腺三酰甘油脂肪酶PNLIP和脂鈣蛋白酶LCN1發(fā)生相互作用，從而干擾肝細(xì)胞脂代謝過程。這可能是HBV介導(dǎo)肝臟脂肪化和炎癥的主要原因。在HBX轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白質(zhì)組研究中，我們共鑒定了4744個(gè)蛋白質(zhì)，其中從12MHBX、24MHBX組及其同窩小鼠中分別鑒定了3491、3464和3442、3298FDR＜1％個(gè)蛋白質(zhì)，四組樣品中共同鑒定的蛋白質(zhì)有2504個(gè)FDR＜1％。在定量研究方面，12MHBX和12MWT組定量分析的蛋白質(zhì)有2816個(gè)，定量數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)值整體呈現(xiàn)正態(tài)分布，其SD值為02024MHBX和24MWT組定量分析的蛋白數(shù)目為2731個(gè)，定量數(shù)據(jù)整體分布的SD值為042。24MHBX組SD值與12MHBX組SD值相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜005），表明在HBX介導(dǎo)的從炎癥向癌癥發(fā)生的進(jìn)程中，肝臟組織的異質(zhì)性在逐漸增加。以20倍差異作為生物學(xué)差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)?2MHBX組樣品中鑒定了22個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中15個(gè)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，7個(gè)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)在24MHBX組發(fā)現(xiàn)97個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中72個(gè)上調(diào)，25個(gè)下調(diào)。差異蛋白質(zhì)的GO分析顯示在12MHBX階段肌肉組織發(fā)育等功能顯著異常，這可能與肝臟星狀細(xì)胞活化引發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)纖維化相關(guān)24MHBX結(jié)果顯示氧化還原、肌肉組織發(fā)育、轉(zhuǎn)錄活性、細(xì)胞骨架組成、糖代謝、脂代謝、小G蛋白信號(hào)途徑等生物學(xué)進(jìn)程顯著富集。尤其是12M和24MHBX介導(dǎo)小鼠肝臟由炎癥向癌癥發(fā)展的過程中，我們分別鑒定了與CDC42信號(hào)途徑相關(guān)的3個(gè)和15個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，這提示CDC42信號(hào)途徑激活可能是HBX介導(dǎo)肝臟炎癥向癌癥發(fā)展的主要原因。在12MHBX炎癥組織中雖然沒有發(fā)現(xiàn)線粒體功能紊亂的線索，但觀察到4個(gè)與脂代謝關(guān)系密切相關(guān)的蛋白如ADFP、DHTKD1、AKR1C18和CES2表達(dá)變化。當(dāng)HBX介導(dǎo)肝臟由炎癥進(jìn)入癌癥階段，18個(gè)線粒體功能相關(guān)蛋白如NDUFA5、LDHD、IVD和DHTKD1等表達(dá)變化顯著。線粒體是細(xì)胞脂肪代謝的主要場(chǎng)所之一，研究結(jié)果暗示脂肪代謝紊亂和線粒體功能失調(diào)可能也是HBX引發(fā)肝臟炎癥進(jìn)展到癌癥的主要原因。將HBX相互作用蛋白質(zhì)組與定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)整合，我們發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)在HBX轉(zhuǎn)染累及的細(xì)胞骨架和線粒體功能方面具有很好的一致性。我們據(jù)此提出“HBX引發(fā)細(xì)胞骨架重塑和線粒體功能失調(diào)擾亂肝細(xì)胞脂代謝過程，誘發(fā)肝臟由炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化”的假設(shè)，并通過免疫組織化學(xué)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行了驗(yàn)證，進(jìn)一步說明了我們定量蛋白組學(xué)研究結(jié)論的正確性。在此基礎(chǔ)上，我們從HBX誘發(fā)小鼠肝臟炎癥和癌癥階段呈現(xiàn)相似差異的蛋白質(zhì)中篩選獲得了與細(xì)胞骨架和脂代謝關(guān)系密切的絲切蛋白COFILIN1，CFL1和脂肪分化相關(guān)蛋白ADIPOSEDIFFERENTIATIONRELATEDPROTEIN，ADFP作為肝病發(fā)生和發(fā)展的候選生物標(biāo)志物分子進(jìn)行了深入研究。利用免疫組織化學(xué)分析臨床HBVHCC和非HBVHCC肝癌組織樣本中的CFL1和ADFP的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)CFL1和ADFP在HBVHCC肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于非HBVHCC，顯示了CFL1和ADFP具有作為生物標(biāo)志物所必需的保守性和組織特異性。按照肝癌早期預(yù)警與診斷標(biāo)志物應(yīng)具備特異性高、敏感、重現(xiàn)性好和患者依從性優(yōu)等要素，我們又進(jìn)一步分析了HBV、HBVHCC和HCV等患者的血清樣本中CFL1和ADFP的蛋白質(zhì)豐度，發(fā)現(xiàn)在HBV以及HBVHCC患者血清中ADFP的豐度顯著升高，而CFL1在血清中未被檢測(cè)到。因此，ADFP可作為HBV誘發(fā)肝細(xì)胞癌早期預(yù)警及診斷的潛在標(biāo)志物。綜上所述，本研究依托實(shí)驗(yàn)室的高覆蓋和高精度定量蛋白組學(xué)研究技術(shù)平臺(tái)，以HBX轉(zhuǎn)基因鼠為基因功能研究模型和SILAC小鼠作為蛋白組學(xué)定量?jī)?nèi)標(biāo)，深入系統(tǒng)地開展了HBX的功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究，揭示了HBX通過誘發(fā)細(xì)胞骨架重塑和干擾線粒體功能引起肝炎向肝癌發(fā)展的分子機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)大量臨床樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)ADFP可能是HBV誘發(fā)的肝細(xì)胞癌的早期預(yù)警及診斷標(biāo)志物，不僅豐富了HBX的生物學(xué)功能及其引發(fā)肝病發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，也為HBV相關(guān)疾病的防診治研究提供了思路和靶標(biāo)。

簡(jiǎn)介：目的病毒性腦炎是由病毒侵犯腦實(shí)質(zhì)引起的炎癥性疾病。臨床表現(xiàn)急性起病、發(fā)熱、頭痛、抽搐、精神異常、意識(shí)障礙，腦電圖異常及相應(yīng)的腦脊液的變化等。臨床以單純皰疹病毒腦炎HSE為最多見，約占10％20％1。病毒性腦炎屬于中醫(yī)溫病范疇，中醫(yī)對(duì)溫病的認(rèn)識(shí)已有數(shù)千年的歷史，在辯證治療上積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，但中醫(yī)辨證多以臨床癥狀為主。利用中西醫(yī)對(duì)照的方法對(duì)病毒性腦炎患者進(jìn)行了分期、分型、實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)與中醫(yī)證候間分布規(guī)律的調(diào)查和分析，以期能為臨床辨證提供客觀依據(jù)。方法參考張慶華楊靜芝3提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期；參考鄭建中田時(shí)雨4提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型；采用日本光電F7320無紙腦電圖儀進(jìn)行腦電圖檢查；采用東芝15T核磁共振成像儀器進(jìn)行影像學(xué)檢查。在進(jìn)行各種檢查之前參考全國(guó)高等醫(yī)藥院校試用教材中醫(yī)內(nèi)科學(xué)和中醫(yī)診斷學(xué)為中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了中醫(yī)辯證分型。所有資料均用SPSS115統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)論1中醫(yī)基本證侯發(fā)生率較高的是火熱證、痰證和風(fēng)證；發(fā)生率較低的是陰虛證、氣虛證和血瘀證。說明火熱、痰、風(fēng)是病毒性腦炎的主要病機(jī)，但陰虛、氣虛和血瘀在病毒性腦炎的發(fā)病中也起重要作用。中醫(yī)基本證侯有三種組合形式，10種組合形態(tài)?；咀C侯組合形式以三證最多，基本證侯的組合形態(tài)以風(fēng)痰熱證最高。說明病毒性腦炎病機(jī)復(fù)雜，臨床需要綜合判斷。21急性期中醫(yī)證侯以熱證、痰證和風(fēng)證為主，而恢復(fù)期以陰虛證、氣虛證為主；2痰證多見于意識(shí)障礙型、精神異常型和混合型，而風(fēng)證多見于混合型；3風(fēng)證在腦電圖重度異常中的發(fā)生率明顯高于腦電圖輕度異常組和腦電圖中度異常組；4風(fēng)證在腦葉組中的發(fā)生率明顯高于丘腦基底節(jié)腦干組。說明病毒性腦炎臨床分期分型、腦電圖改變及病理改變與中醫(yī)證侯之間有一定的相關(guān)性?？勺鳛榕R床辯證的參考指標(biāo)。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)分類號(hào)R7337R7337學(xué)校代碼學(xué)校代碼103910392學(xué)科專業(yè)代碼學(xué)科專業(yè)代碼100208100208學(xué)號(hào)學(xué)號(hào)21210032292121003229碩士碩士學(xué)位學(xué)位論文論文論文題目論文題目慢病毒介導(dǎo)慢病毒介導(dǎo)HSAMIR223過表達(dá)對(duì)過表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究EFFECTSOFLENTIVIRUSMEDIATEDHSAMIR223OVEREXPRESSIONONBIOLOGICALPROPERTIESOFK562學(xué)位類別別醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)碩士碩士所在學(xué)院協(xié)和臨床醫(yī)學(xué)院協(xié)和臨床醫(yī)學(xué)院申請(qǐng)人姓名莫慧玲姓名莫慧玲學(xué)科、?？?、專業(yè)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)業(yè)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)導(dǎo)師曹穎平師曹穎平教授教授答辯委員會(huì)主席伍嚴(yán)安答辯委員會(huì)主席伍嚴(yán)安教授教授研究起研究起止時(shí)間止時(shí)間20142014年1111月至月至20152015年5月答辯日期期20152015年5月2929日二○一五○一五年五月目錄中文摘要中文摘要1ABSTRACT3前言5第一部分第一部分MIRMIR223223慢病毒過表達(dá)重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建慢病毒過表達(dá)重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建及在及在K562K562細(xì)胞細(xì)胞中的表達(dá)情況中的表達(dá)情況81材料811細(xì)胞株812慢病毒載體系統(tǒng)813慢病毒載體構(gòu)建及表達(dá)的主要試劑814慢病毒載體構(gòu)建及表達(dá)的主要儀器915其他實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑和主要儀器916主要試劑的配置102實(shí)驗(yàn)方法1221PCR擴(kuò)增目的基因片段1222割膠回收1323大腸桿菌感受態(tài)的制備1424目的基因同源重組入表達(dá)載體1425重組質(zhì)粒鑒定1626陽性重組質(zhì)粒的大量抽提163慢病毒的包裝1731包裝病毒293T細(xì)胞的復(fù)蘇1732293T細(xì)胞的傳代1733陽性重組質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染1834慢病毒的收獲和濃縮1835慢病毒滴度測(cè)定194K562細(xì)胞的培養(yǎng)1941培養(yǎng)基成份19

簡(jiǎn)介：本論文包括兩部分1犬細(xì)小病毒CPV基因組克隆和生物學(xué)特性研究；2狂犬病病毒N基因的原核表達(dá)及應(yīng)用第一部分犬細(xì)小病毒病由犬細(xì)小病毒CPV引起，臨床癥狀以出血性腸炎和心肌炎為特征，是目前威脅養(yǎng)犬業(yè)的主要傳染病。犬細(xì)小病毒是一種線性單鏈DNA病毒，全長(zhǎng)基因組為5323BP，由兩個(gè)開放的讀碼框編碼2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，為自主復(fù)制的細(xì)小病毒。本研究首先從發(fā)病犬的糞便中分離獲得了一株北京地區(qū)2004年流行的CPV病毒株，命名為CPVB2004，根據(jù)GENBANK已發(fā)表序列設(shè)計(jì)引物，采用分段PCR的方法獲得該病毒的兩個(gè)基因片段，并克隆到PMDT18載體，分別命名為PMDCPV2132和PMDCPV2925，連接這兩個(gè)DNA片段構(gòu)建包含幾乎全長(zhǎng)基因組的克隆，命名為PMDCPV4623，進(jìn)行序列測(cè)定。基因組序列分析顯示該分離株B2004與GENBANK發(fā)表序列的核苷酸序列相似性大于993％，與歐洲新西蘭的分離株遺傳關(guān)系最近；分析NS1及VP1的DNA核苷酸序列和蛋白氨基酸序列顯示了相同的特點(diǎn)而且與編碼非結(jié)構(gòu)蛋白讀碼框的核苷酸序列相比，編碼結(jié)構(gòu)蛋白的讀碼框核苷酸序列變異較大。與CPVD和CPVB1979完全基因組序列比對(duì)，除了在編碼區(qū)特別是結(jié)構(gòu)蛋白存在一些變異外，3′端非編碼區(qū)在266位缺失了AACC四個(gè)堿基；5′端非編碼區(qū)45544616位與全長(zhǎng)的基因組CPVD相對(duì)應(yīng)缺失了62BP的重復(fù)序列，47654890丟失了125BP的重復(fù)序列，即兩個(gè)62BP的重復(fù)序列。根據(jù)VP2的氨基酸序列分析，與已有的標(biāo)準(zhǔn)CPV基因型比較發(fā)現(xiàn)，該毒株426位氨基酸為ASN，555位氨基酸殘基為VAL，為目前流行的CPV2A型分析VP2的核苷酸序列和氨基酸序列同樣得出，CPVB2004與臺(tái)灣和歐洲的CPV2A遺傳關(guān)系較近，屬于同一個(gè)分枝。為了研究該病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞定位，構(gòu)建了表達(dá)VPLN端區(qū)和VP2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFPVP1和PEGFPVP2，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48H后激光共聚焦顯微鏡LSM510，ZEISS下觀察GFP的表達(dá)，了解病毒衣殼蛋白的核運(yùn)輸功能。轉(zhuǎn)染PEGFPC1載體的細(xì)胞，熒光表達(dá)量大，且僅存在于細(xì)胞質(zhì)；而轉(zhuǎn)染PEGFPVP1的細(xì)胞熒光表達(dá)主要集中于細(xì)胞核，也有部分顯示在細(xì)胞核的邊緣轉(zhuǎn)染PEGFPVP2的細(xì)胞熒光表達(dá)則在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中分散分布。這些結(jié)果表明重組了VPLN端11個(gè)氨基酸殘基MAPPAKRARRG的PEGFPVP1主要在細(xì)胞核產(chǎn)生熒光，這11個(gè)氨基酸是較強(qiáng)的核定位序列，能夠運(yùn)送錨釘?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)而證明了VP1N端單一區(qū)的核定位功能。而攜帶了GFP的VP2沒有足夠強(qiáng)的核運(yùn)輸功能，把GFP全部運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核。為了進(jìn)一步了解CPV的生物學(xué)特點(diǎn)，觀察了CPV的感染過程，激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒接種細(xì)胞后448H的CPV病毒粒子的亞細(xì)胞定位，病毒在接種細(xì)胞8H內(nèi)位于細(xì)胞質(zhì)；812H進(jìn)入細(xì)胞核，開始復(fù)制，約16H在細(xì)胞核內(nèi)積累大量病毒粒子，24H后出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)，3248H充滿于整個(gè)細(xì)胞。通過激光共聚焦研究轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和CPV進(jìn)入的關(guān)系表明，CPV與轉(zhuǎn)鐵蛋白使用相同的受體進(jìn)入細(xì)胞，并且在進(jìn)入后2H共定位于細(xì)胞核周質(zhì)；制備不同組織的原代細(xì)胞，接種CPV和TF孵育發(fā)現(xiàn)，TFR是CPV病毒組織特異性的原因，但也有其它因素影響CPV在不同組織細(xì)胞的復(fù)制。根據(jù)獲得序列設(shè)計(jì)4對(duì)SIRNA寡聚核苷酸，構(gòu)建PSISTRIKE系列的U6發(fā)卡結(jié)構(gòu)載體，研究質(zhì)粒介導(dǎo)的SIRNA對(duì)CPV病毒復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，分別以CPV的核衣殼蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因?yàn)榘谢?，選擇的4段21NT的保守序列，構(gòu)建了小發(fā)夾RNASHTHAIRPINRNA，SHRNA的PSISTRIKE表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染FK81細(xì)胞篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過病毒感染檢測(cè)、細(xì)胞活度測(cè)定和TCID測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該種方法介導(dǎo)的SHRNA表達(dá)質(zhì)粒能抑制CPV病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和感染，具有抗病毒作用，但不能完全阻斷病毒的感染。第二部分狂犬病是由狂犬病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的人獸共患傳染病，一旦發(fā)病無法救治，100％死亡。狗是最主要的宿主，而且也是感染人與其它動(dòng)物的主要傳播媒介；目前尚無有效的治療方法，疫苗接種是預(yù)防狂犬病的唯一有效途徑。家養(yǎng)和野生動(dòng)物接種疫苗并保持較高的抗體水平是預(yù)防和控制狂犬病的最有效途徑，因而對(duì)家養(yǎng)和野生動(dòng)物狂犬病免疫后中和抗體效價(jià)的監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建和保存的質(zhì)粒PGEMTNPCTN為基礎(chǔ)，將N基因亞克隆到表達(dá)載體PMALC2X中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒PMALNP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細(xì)胞誘導(dǎo)其表達(dá)。WESTERN印跡和ELISA驗(yàn)證了表達(dá)純化的MBPNP融合蛋白的抗原性和免疫原性。利用此融合蛋白作為包被抗原，構(gòu)建了一個(gè)檢測(cè)血清中抗狂犬病抗體水平的間接ELISA檢測(cè)體系，通過測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、陽性血清和采自免疫接種過狂犬病疫苗的犬科動(dòng)物的抗體水平，表明該EIJSA方法敏感性高，特異性好。測(cè)定樣品ELISA的OD值與標(biāo)準(zhǔn)方法RFFIT。測(cè)得的中和抗體滴度兩者具有很高的相關(guān)性R09436。安全方便的重組MBPNP融合蛋白能夠用于檢測(cè)犬科動(dòng)物的抗狂犬病抗體水平和免疫原。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多黃酮類似物的合成、抗病毒活性篩選及十八烷氧乙基替諾福韋酯的合成工藝、抗乙肝病毒藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：中南大學(xué)博士學(xué)位論文EB病毒感染對(duì)MICRNA203的表達(dá)影響及其相互作用是鼻咽癌發(fā)病學(xué)的重要機(jī)制姓名俞海波申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師李桂源；盧建紅20120603博士學(xué)位論文中文摘要MIR203調(diào)控新靶基因E2F3、CCNGL參與抑制上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和惡性轉(zhuǎn)化能力】通過MIRBASE軟件分析差異表達(dá)MIRNA分子的基本信息，在線MIRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件TARGETSCAN和MIRANDA對(duì)下游靶基因進(jìn)行分析，并利用熒光素報(bào)告載體活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)E2F3和CCNGL是MIR203的直接調(diào)控的新靶基因。RTPCR和WESTEMBLOT結(jié)果顯示MIR203可以在MRNA和蛋白質(zhì)水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。MTT和流式細(xì)胞結(jié)果表明MIR203具有抑制上皮細(xì)胞生長(zhǎng)能力，能抑制細(xì)胞從GO／G1期向S期轉(zhuǎn)換的進(jìn)程；MIR203明顯抑制裸鼠移植瘤腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。免疫組化和原為雜交結(jié)果顯示MIR203過表達(dá)的裸鼠瘤組織中靶基因E2F3和CCNGL表達(dá)下調(diào)。在上皮細(xì)胞中過表達(dá)靶基因E2F3和CCNGL能夠逆轉(zhuǎn)MIR203對(duì)上皮細(xì)胞生物學(xué)功能的影響?！綥MPL是EB、下調(diào)MIR203的關(guān)鍵病毒蛋白，并且通過激活JNK和NFKB信號(hào)通路調(diào)控MIR203的表達(dá)】潛伏膜蛋白LMPL和LMP2是EBV編碼的重要癌蛋白。QRTPCR結(jié)果證實(shí)EBV通過LMPL參與調(diào)控PRIMIR203和MATUREMIR203表達(dá)下調(diào)而LMP2卻無此功能；在EBV和LMPL穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的上皮細(xì)胞中沉默LMPL表達(dá)后，MIR203的表達(dá)量恢復(fù)明顯。免疫組化和原位雜交結(jié)果顯示MIR203在NPC旁較癌組織中表達(dá)高；LMPL表達(dá)陰性NPC組織較陽性癌組織的MIR203表達(dá)明顯增高。LMPL發(fā)揮生物學(xué)功能的主要區(qū)域是C端的C“岷L、CTAR2和CTAR3結(jié)構(gòu)域。WESTERNBLOT和QRTPCR結(jié)果顯示LMP1蛋白CTARL和CTAR2結(jié)構(gòu)域通過激活JNK和NFKB信號(hào)通路調(diào)控MIR203的表達(dá)；而P38信號(hào)通路對(duì)MIR203的表達(dá)沒有明顯影響。同時(shí)，II

簡(jiǎn)介：計(jì)算機(jī)病毒防治是計(jì)算機(jī)信息安全領(lǐng)域的重要課題。隨著全世界網(wǎng)絡(luò)化的程度越來越高，病毒給全世界造成的經(jīng)濟(jì)損失還會(huì)越來越大。目前反病毒技術(shù)大都是殺毒軟件隨著病毒的出現(xiàn)而不斷的升級(jí)，在時(shí)間上具有一定的滯后性，這就給我們提出了一個(gè)問題防病毒措施是否可以做到變被動(dòng)為主動(dòng)，當(dāng)遇有未知病毒或外來入侵時(shí)使其可以具有真正的主動(dòng)防御能力考慮計(jì)算機(jī)病毒以及生物病毒的一些特點(diǎn)，我們運(yùn)用生物學(xué)的理論去尋找具有真正意義的主動(dòng)防御能力的反病毒措施。一方面可以說是從宏觀方面考慮，主要通過整體分析病毒的傳播情況來考慮反病毒措施。由于病毒的傳播特性獨(dú)立于每個(gè)病毒的具體特征而普遍存在，因此可以通過抽取病毒在傳播方面的公共特征而忽略其具體表現(xiàn)形式，建立正確反應(yīng)病毒傳播特性的數(shù)學(xué)模型，本文在第三章在17的基礎(chǔ)上把生物流行病傳播模型應(yīng)用于無尺度網(wǎng)絡(luò)上計(jì)算機(jī)病毒的傳播，通過模型可以更準(zhǔn)確地了解病毒的傳播過程，主要比較了兩種不同的殺毒措施的不同效果。另一方面從微觀考慮，主要是利用人工免疫系統(tǒng)檢測(cè)和清除個(gè)體病毒。第四章主要利用生物免疫系統(tǒng)的機(jī)制來考慮計(jì)算機(jī)病毒，在此提出對(duì)人工免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵模塊識(shí)別器進(jìn)行聚類演化的思想。以上兩個(gè)方面都是基于生物理論來解決計(jì)算機(jī)病毒問題，目標(biāo)都是尋求能夠快速、自動(dòng)、演繹的查殺各種未知病毒，遏制病毒的快速繁衍和傳播的方法。