腸道病毒71型3D核酸聚合酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、手足口病是一類主要由小RNA病毒科腸道病毒屬病毒引起的傳染病,主要感染對象是嬰幼兒,Enterovirus71(EV71)與Coxsackievirus A16(CVA16)是引起手足口病的兩個最主要病原體。在2009年1月至2011年5月期間,我國發(fā)現(xiàn)的由EV71流行引起的感染病例超過了200萬,其中約有1000人死亡。并且EV71的感染者常常會產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)疾病,而CVA16導(dǎo)致的手足口病則不會有嚴重的并發(fā)癥。所以,針對EV71的研究

2、備受人們關(guān)注。
　　 EV71病毒為單股正鏈RNA病毒,基因組約有7.5kb。該基因組編碼一個約250kDa的多聚蛋白,這個多聚蛋白被自身產(chǎn)生的2A蛋白酶(2Apro)和3C蛋白酶(3Cpro)切割,產(chǎn)生11個成熟的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中以RNA為模板的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp),即水解后所產(chǎn)生的3Dpol,主要負責病毒的復(fù)制,是抗病毒藥物設(shè)計的主要靶點之一。
　

3、　 解析出3Dpol的結(jié)構(gòu),再根據(jù)結(jié)構(gòu)特征篩選出特異性的抑制劑,對防治手足口病具有重要意義。我們將3Dpol構(gòu)建在了實驗室改造的含有TEV蛋白酶酶切位點的pGEX-4T-1上來表達蛋白,并通過GST親和層析、離子交換和分子篩純化獲得了較純的蛋白。在篩選了大約1800個結(jié)晶條件并對有效條件進行了進一步優(yōu)化后,獲得了衍射結(jié)果較好的蛋白晶體。通過在上海同步輻射光源(SSRF)的衍射實驗,我們獲得的3Dpokl分辨率達到了2.4(A)。這對基