犬細(xì)小病毒的基因組克隆和生物學(xué)特性研究及狂犬病病毒N基因的原核表達(dá).pdf

1、本論文包括兩部分：1)犬細(xì)小病毒(CPV)基因組克隆和生物學(xué)特性研究；2)狂犬病病毒N基因的原核表達(dá)及應(yīng)用第一部分： 犬細(xì)小病毒病由犬細(xì)小病毒(CPV)引起，臨床癥狀以出血性腸炎和心肌炎為特征，是目前威脅養(yǎng)犬業(yè)的主要傳染病。犬細(xì)小病毒是一種線性單鏈DNA病毒，全長基因組為5323bp，由兩個(gè)開放的讀碼框編碼2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，為自主復(fù)制的細(xì)小病毒。 本研究首先從發(fā)病犬的糞便中分離獲得了一株北京地區(qū)2004年流行

2、的CPV病毒株，命名為CPV-B2004，根據(jù)Genbank已發(fā)表序列設(shè)計(jì)引物，采用分段PCR的方法獲得該病毒的兩個(gè)基因片段，并克隆到pMD-T18載體，分別命名為pMD-CPV/2132和pMD-CPV/2925，連接這兩個(gè)DNA片段構(gòu)建包含幾乎全長基因組的克隆，命名為pMD-CPV/4623，進(jìn)行序列測定?；蚪M序列分析顯示該分離株B2004與Genbank發(fā)表序列的核苷酸序列相似性大于99.3％，與歐洲(新西蘭)的分離株遺傳關(guān)系最

3、近；分析NS1及VP1的DNA核苷酸序列和蛋白氨基酸序列顯示了相同的特點(diǎn)：而且與編碼非結(jié)構(gòu)蛋白讀碼框的核苷酸序列相比，編碼結(jié)構(gòu)蛋白的讀碼框核苷酸序列變異較大。與CPV-d和CPV-b(1979)完全基因組序列比對，除了在編碼區(qū)特別是結(jié)構(gòu)蛋白存在一些變異外，3′端非編碼區(qū)在266位缺失了aacc四個(gè)堿基；5′端非編碼區(qū)4554-4616位(與全長的基因組CPV-d相對應(yīng))缺失了62bp的重復(fù)序列，4765-4890丟失了125bp的重復(fù)序

4、列，即兩個(gè)62bp的重復(fù)序列。根據(jù)VP2的氨基酸序列分析，與已有的標(biāo)準(zhǔn)CPV基因型比較發(fā)現(xiàn)，該毒株426位氨基酸為Asn，555位氨基酸殘基為Val，為目前流行的CPV-2a型：分析VP2的核苷酸序列和氨基酸序列同樣得出，CPV-B2004與臺灣和歐洲的CPV-2a遺傳關(guān)系較近，屬于同一個(gè)分枝。 為了研究該病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞定位，構(gòu)建了表達(dá)VPl N端區(qū)和VP2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-vp1和pEGFP-vp2，轉(zhuǎn)染細(xì)胞4

5、8h后激光共聚焦顯微鏡(LSM510，Zeiss)下觀察GFP的表達(dá)，了解病毒衣殼蛋白的核運(yùn)輸功能。轉(zhuǎn)染pEGFP-c1載體的細(xì)胞，熒光表達(dá)量大，且僅存在于細(xì)胞質(zhì)；而轉(zhuǎn)染pEGFP-vp1的細(xì)胞熒光表達(dá)主要集中于細(xì)胞核，也有部分顯示在細(xì)胞核的邊緣：轉(zhuǎn)染pEGFP-vp2的細(xì)胞熒光表達(dá)則在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中分散分布。這些結(jié)果表明重組了VPl N端11個(gè)氨基酸殘基(MAPPAKRARRG)的pEGFP-vp1主要在細(xì)胞核產(chǎn)生熒光，這11個(gè)氨基

6、酸是較強(qiáng)的核定位序列，能夠運(yùn)送錨釘?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核：進(jìn)而證明了VP1 N端單一區(qū)的核定位功能。而攜帶了GFP的VP2沒有足夠強(qiáng)的核運(yùn)輸功能，把GFP全部運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核。 為了進(jìn)一步了解CPV的生物學(xué)特點(diǎn)，觀察了CPV的感染過程，激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒接種細(xì)胞后4—48h的CPV病毒粒子的亞細(xì)胞定位，病毒在接種細(xì)胞8h內(nèi)位于細(xì)胞質(zhì)；8—12h進(jìn)入細(xì)胞核，開始復(fù)制，約16h在細(xì)胞核內(nèi)積累大量病毒粒子，24h后出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)，32—4

7、8h充滿于整個(gè)細(xì)胞。通過激光共聚焦研究轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和CPV進(jìn)入的關(guān)系表明，CPV與轉(zhuǎn)鐵蛋白使用相同的受體進(jìn)入細(xì)胞，并且在進(jìn)入后2h共定位于細(xì)胞核周質(zhì)；制備不同組織的原代細(xì)胞，接種CPV和Tf孵育發(fā)現(xiàn)，TfR是CPV病毒組織特異性的原因，但也有其它因素影響CPV在不同組織細(xì)胞的復(fù)制。根據(jù)獲得序列設(shè)計(jì)4對SiRNA寡聚核苷酸，構(gòu)建psiSTRIKE系列的U6發(fā)卡結(jié)構(gòu)載體，研究質(zhì)粒介導(dǎo)的siRNA對CPV病毒復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，分別以CPV

8、的核衣殼蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因?yàn)榘谢?，選擇的4段21nt的保守序列，構(gòu)建了小發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)的psiSTRIKE表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染FK81細(xì)胞篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過病毒感染檢測、細(xì)胞活度測定和TCID<,50>)測定，發(fā)現(xiàn)該種方法介導(dǎo)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒能抑制CPV病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和感染，具有抗病毒作用，但不能完全阻斷病毒的感染。第二部分： 狂犬病是由狂犬病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的

9、人獸共患傳染病，一旦發(fā)病無法救治，100％死亡。狗是最主要的宿主，而且也是感染人與其它動物的主要傳播媒介；目前尚無有效的治療方法，疫苗接種是預(yù)防狂犬病的唯一有效途徑。家養(yǎng)和野生動物接種疫苗并保持較高的抗體水平是預(yù)防和控制狂犬病的最有效途徑，因而對家養(yǎng)和野生動物狂犬病免疫后中和抗體效價(jià)的監(jiān)測就顯得尤為重要。以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建和保存的質(zhì)粒pGEM-T/NP(CTN)為基礎(chǔ)，將N基因亞克隆到表達(dá)載體pMAL-c2x中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pMal

10、-NP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細(xì)胞誘導(dǎo)其表達(dá)。Western印跡和ELISA驗(yàn)證了表達(dá)純化的MBP-NP融合蛋白的抗原性和免疫原性。利用此融合蛋白作為包被抗原，構(gòu)建了一個(gè)檢測血清中抗狂犬病抗體水平的間接ELISA檢測體系，通過測定標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、陽性血清和采自免疫接種過狂犬病疫苗的犬科動物的抗體水平，表明該EIJSA方法敏感性高，特異性好。測定樣品ELISA的OD值與標(biāo)準(zhǔn)方法RFFIT。測得的中和抗體滴度兩者具有很高的相關(guān)性(r=0.94