犬細小病毒VP-,2-基因的克隆、表達與鑒定.pdf

1、犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canineparvovirus，CPV)感染引起的犬的一種急性傳染病，以劇烈的嘔吐、出血性腸炎和白細胞顯著減少為主要特征，并可引起犬急性心肌炎。該病發(fā)病急，病程短，傳染性強，死亡率高，是危害我國養(yǎng)犬業(yè)最為嚴重的傳染病之一，可造成嚴重的經濟損失。 根據(jù)GeneBank已發(fā)表的犬細小病毒VP2基因序列，設計一對特異引物，采用SDS-蛋白酶K-酚氯仿抽提法，從犬細小病毒/犬瘟熱二聯(lián)苗中提取犬細小病毒的基因

2、組DNA，并以此為模板進行PCR擴增，獲得了犬細小病毒VP2基因，將其克隆到質粒pET22b(+)的相應位點上。重組質粒經酶切鑒定和核苷酸序列分析，結果表明所插入的閱讀框正確，序列無誤，從而成功地構建了pET22b/VP2原核表達載體。 將測序正確的重組質粒pET22b/VP2分別轉化E.coliBL21(DE3)和E.coliRosettaTM(DE3)兩種不同宿主菌，IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳結果表明：重組質粒p

3、ET22b/VP2在E.coliBL21(DE3)中未見明顯的目的蛋白表達帶；而在E.coliRosettTM(DE3)中則獲得了高效表達，在相應位置上(68kd處)可見明顯的目的蛋白表達帶；重組蛋白主要以包涵體的形式表達，且表達量占菌體總蛋白的30％以上；Ni2+親和層柱純化收集蛋白，純化后的蛋白經復性處理后，能與犬細小病毒陽性血清發(fā)生特異反應。 本試驗成功地克隆了犬細小病毒VP2基因完整片段，并實現(xiàn)了其在原核表達系統(tǒng)中的高效