豬細(xì)小病毒VP2蛋白親和肽的篩選與鑒定.pdf

1、豬細(xì)小病毒是引起豬繁殖障礙的重要病原之一，該病廣泛存在于世界各地并在大多數(shù)豬場流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失，因此豬細(xì)小病毒一直是豬病研究的熱點(diǎn)之一。VP2蛋白是PPV病毒粒子的主要衣殼蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗PPV中和抗體，且基因序列保守，其表達(dá)的蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，故VP2蛋白在豬細(xì)小病毒診斷試劑及新型疫苗研究領(lǐng)域具有重要價(jià)值。
　　 本研究根據(jù)GenBank發(fā)表的PPV BQ株的基因序列，設(shè)計(jì)一對引物，通過PCR擴(kuò)增得到V

2、P2基因片段，長度為1740bp。酶切后插入原核表達(dá)載體pET32a(+)的T7啟動子下游，構(gòu)建的重組質(zhì)粒VP2-pET32a經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在E.coli Rosetta中進(jìn)行高效表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物分子量為82KDa，與預(yù)期大小一致，主要以包涵體的形式存在。Westernblot顯示，該蛋白能與感染PPV豬的陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明該重組蛋白具有抗原性，可以作為鑒別診斷用抗原。
　　 噬菌體展示技術(shù)是

3、一種靶蛋白配體篩選方法。本試驗(yàn)以VP2蛋白為靶分子，利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫，對VP2重組蛋白進(jìn)行了五輪生物淘選。在第四輪篩選表達(dá)載體pET32a(+)的標(biāo)簽蛋白，從第五輪洗脫物噬菌斑中隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆菌落，進(jìn)行核酸序列的測定及多肽序列的推導(dǎo)，其結(jié)果表明，對靶分子經(jīng)過5輪篩選后，最終篩選出6種親和力的十二肽。將親和力最高和重復(fù)性最好的2個(gè)序列進(jìn)行合成，分別為1號肽：HTHQLHFLNHNP；2號肽：HNLHLYHYLRSA。通過MTT